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微生物室“最”难啃的硬骨头——定植菌or致病菌的决择!

归去来兮 2021-8-19 106人围观 技术


作者:郭绪平
单位:重庆三峡医专附属中医院检验科


案例分析

   
患者陈XX,男,50岁,因突发晕厥后倒地伴言语不清5天,于2012-04-01入住我院ICU。入院症见:患者神清,精神差,言语不清。反应迟钝,饮水呛咳,纳眠欠佳,二便调,体重无明显减轻。既往有“2型糖原病”病史8年,血糖控制欠佳,有精神分裂症20年,家属诉控制较可,有胆囊切除、左小腿骨折史,具体家属记不清;否认高血压、结核、肝病、慢性肾病、冠心病、胃溃疡;无输血史;无药物、实物过敏史。患者因5-(15-17)连续三天尿常规干化学白细胞阳性,尿白细胞计数超过正常值,于是5-18送了第一次尿培养。

第一次尿定量培养24小时血平板上可见灰白色、扁平菌落、湿润的纯菌,且菌落计数>104CFU/L,镜下为革兰阳性球菌,成葡萄状排列。(如图1、2)

 
那么就按照阳性球菌的鉴定流程进行下一步的鉴定,如(图3):

(图3)

立即触媒实验(方法:取已制作好的0.5麦氏单位的纯菌悬液,放在洁净的玻片上,再滴加3%双氧水(放棕色瓶保存,防止被氧化分解)在菌液上,60S内出现大面积气泡(不能搅动,以免发生假阳性),如(图4)右边为阳性(大量的气泡),左边是盐水对照:均匀浑浊,无变化。



触媒阳性的革兰阳性球菌(图4),多为葡萄球菌(金黄色葡萄球菌厌氧亚种和解葡萄球菌触媒阴性)或者微球菌属如黏滑罗氏菌(黏滑罗氏菌触媒阳性有时阳性,有时弱阳性,镜下形态跟葡萄球菌差不多,菌落如(图5),当其触媒阳性的时候很难区分,唯一的办法是盐水实验,黏滑罗氏菌阳性,葡萄球菌阴性)。

(图6)

由于葡萄球菌能够发酵乳糖,两管都变黄,而微球菌是氧化性,结果如(图6)左边第一副图,中间一幅图是产碱型,需氧厌氧均不发酵糖。


因此可以确定本例的细菌是葡萄球菌,拿出葡萄球菌的鉴定卡,同时做血浆凝固酶实验:取含EDTA的三份(防止凝血因子的缺如)人血浆混匀,稀释4倍,再加入已配制好的0.5麦氏单位的菌悬液等量混匀,玻片法10S看结果,试管法放置35度孵箱,每隔一小时观察一次,一般凝固酶阳性的葡萄球菌会在4个小时出现明显阳性(中间葡萄球菌和猪葡萄球菌需要放置12-24小时)。


试管法凝固酶的判读:有任何程度的凝块都应该是阳性。


图7

如(图7),上面是盐水对照均匀浑浊(-),下面是阳性对照,使劲摇晃凝块也不散。而这位患者实验结果为均匀浑浊,表示试管法阴性。本次实验,玻片和试管法都为阴性,说明凝固酶为阴性生化和药敏16-20小时鉴定结果为表皮葡萄球菌(MRS.)(图8)

图8

表皮葡萄球菌多为皮肤定植菌,但在尿中出现,难道是污染菌?建议重新取材送检。
    

   

5-22日送了第二次尿培养。


培养结果:除表皮葡萄球菌2+外,还有念珠菌+(图9),尿原始涂片:革兰阳性球菌(+)和少量真菌孢子及假菌丝,未见明显吞噬。


图9

询问临床,是否有泌尿道的脓肿、梗阻或者结石?患者做了腹部CT、B超显示无异常,排除以上原因。两次都培养出表皮葡萄球菌,而且标本合格,葡萄球菌到底是定值(患者从入院开始一直导尿)还是致病菌?又从何而来?平时我们的尿培养以肠杆菌居多,其次是非发酵菌,肠球菌,真菌等,跟文献报道的差不多(图10)。


图10

患者除了尿道有少量出血,没有明显的泌尿道症状。

【5-22日血常规
WBC总数:7.68x109/L;
分类N:75%;
BPC:589x109/L;
CRP:38mg/L
PCT正常,肾功能正常。

奇怪的是5-22白细胞脂酶2+,亚硝酸盐+,尿白细胞计数却为零。通常情况亚硝酸盐阳性代表有细菌感染:细菌把人体内的硝酸盐还原成亚硝酸盐,指示剂发生颜色改变;白细胞脂酶阳性代表尿里有中性粒细胞或者单核细胞,可是白细胞计数为0,这不是自相矛盾吗?难道是尿常规报告有误?不可能呀,这样的尿常规结果触犯了本室的复检规则,会人工镜检的,于是询问了当天做该标本的人,说已复检,手工跟仪器结果吻合。

于是再次与临床沟通:据医生的观察,她们每次给患者冲洗后尿里的红细胞就会减少。我豁然开朗,白细胞也有这种可能。于是建议临床,无菌操作,冲洗膀胱,重新换导管,排除前段尿(有可能有宿尿,患者没有意识,没有自主排尿功能、自主清洁能力),然后用针从尿管前段侧面进入,抽取立刻送检。


5-31送了第三次尿培养培养结果同第二次培养一样。多数为表皮葡萄球菌,有少量的念珠菌,三次都培养出同样的细菌,表皮葡萄球菌是致病菌吗?如果是,为什么培养的结果跟尿常规不一致呢?

图11

干化学的白细胞是测的中性粒细胞、单核细胞里的脂酶,如果尿里出现的是淋巴细胞,干化学白细胞会是阴性,亚硝酸盐阳性,一般来说代表有细菌感染。5-22 亚硝酸盐阳性,白细胞脂酶阳性,而计数为0,培养阳性;5-31号,白细胞计数比前期增多176个,脂酶阳性,但亚硝酸盐阴性,培养阳性。再次询问临床,患者病情平稳,没有明显泌尿系统感染迹象,百思不得其解。但有一点可以肯定,表皮葡萄球菌不是污染菌。

翻阅患者住院以来的所有检查,显示泌尿系统没有任何异常,查看了了刚入院时的检查报告。

血常规
白细胞总数:12.94X109/L;
分类N:88%;
BPC:856X109/L,较高;
CRP:80mg/l,其余炎症指标正常。

患者自主能力差,一直插着尿管。病历显示一开始有明显的血凝块,随着治疗的跟进,无明显血凝块。

尿常规于4-26显示(图12)红细胞正常,说明出血得到控制,但后面尿常规又多次检测到红细胞及白细胞,会不会是反复插管(每周换一次,患者导尿2个月)对黏膜造成的机械性损伤引起出血,且由于护理不当把皮肤、黏膜的葡萄球菌带到了尿道呢?

图12

尽管我院从尿道分离的表皮葡萄球菌不到1%,但文献上也有类似相同的实例。尽管每次取标本都有冲洗,很可能白细胞被冲走了,而葡萄球菌粘附力强容易扶着在导管上,形成生物被膜,不容易被清除掉。与临床交流,建议试机取出导管,培养导管段是否有定植菌。

6-5日,临床取出导尿管,剪去前端,取留置在尿道里的那段导管培养,并原始标本直接涂片,镜下可见大量的革兰阳性球菌,散在或者成葡萄状排列(图13),导管段也培养出大量的革兰阳性球菌(后分纯鉴定为表皮葡萄球菌(MRS))和念珠菌(图14)。可以断定此前的尿培养生长出的表皮葡萄球菌多来自于导管。那么,导管里的葡萄球菌是否引起了尿路感染呢?


据文献报道,葡萄球菌引起的尿路感染多由表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌引起,表皮葡萄球菌多有留置导管所致,多见于前列腺切除术后的患者。一般无症状,移除导管后病原菌消失,但也少数患者会出现症状,需要抗菌药物的治疗。所以我们建议临床,导管移除后3天后再取中段尿培养。

几天后尿培养,未培养出葡萄球菌和念珠菌,尿常规,全部阴性。那么现在可以肯定的是前期的葡萄球菌和念珠菌均为来自导管的定植菌,这也能够解释为什么白细胞时有时无。由于每次做尿培养要进行尿道的冲洗,附着在导管上的白细胞要么被葡萄球菌干掉,要么被水冲走,而葡萄球菌有强大的生物被膜,把细菌包裹在导管上,被冲走的数量少,文献也曾报道过留置导尿的时间是影响导尿管管壁形成生物膜的危险因素!因此无论我们怎么清洁,消毒,每次都能够培养出大量的葡萄球菌。


那么哪些细菌在尿里出现有意义?


一般来说,对于合格尿标本尿培养出的淋球菌、支原体、衣原体、梅毒螺旋体、杜克雷嗜血杆菌等具有永远的临床意义,其他细菌是否有临床意义,一般的判读原则是:

1、直接涂片:发现大量炎性细胞,并且有较多的吞噬、包裹或者伴行(图15),菌体单一有意义(这里需要说明的是有细菌的地方一定会吸引炎性细胞)。导管也同样道理,可是导管里的白细胞只能代表它作用于导管内的细菌,当尿里出现白细胞的时候,并不一定代表有炎症。当导管里有大量细菌定值时,患者在排尿时,白细胞也会顺着导管里的尿流出来。

图15

2、细菌培养:培养多次均为同一种菌,而且G+co>104或者G-b>105有意义。

3、临床有相应的感染症状有意义。

4、抗生素治疗有效。

几种因素必须综合考虑,不然会错报或者漏报,两者都会严重影响患者身体健康。何为导管定植菌,也有文献做了详细说明,如(图16)所示。

图16

回到本次病例,答案已经很清楚了,表皮是导管的定植菌。由此看出:微生物室不能闭关自守,一定要走出实验室,下到临床去了解疾病发生、发展情况、标本、用药情况等,我们培养出的阳性、阴性结果,与其它实验指标相结合,还要不断更新大脑库存。


比如尿分析和显微镜检测共识中指出:脓尿对培养有帮助,但对导管尿来说,可能是定植或病原菌,尿白细胞计数的一般升高,不是致病菌的特异性指标。微生物知识更新非常的快,必须时刻关注最新动态,基本每年CLSI都有知识更新,如果不加强学习,吃老本,很容易闹笑话,给临床错误的信息,延误病情,后果不堪设想。


图17

对微生物来说除了更新知识库,基础不能丢,东科老师曾说“形态学是佐证培养正确与否的唯一证据”。微生物工作跟其他亚专业有相同之处,但也有不同之处,比如,我们培养出来一个菌,有的人就只是简单做个鉴定加药敏就把报告发给临床,至于报告是否能给临床提供帮助,也不曾去追问过。这样从事经验工作,跟机器人没有区别,在发报告之前,一定要仔细分析报告,分析这个菌是不是真正的病原菌?它常在什么部位出现,常引起什么样的疾病,它来自哪里?
  

  
下面举个例:比如初学者一般都认为金葡是毒力强,在哪里都是致病菌。答案是错的,初做微生物,我也是这样认为的,事实不然,金葡是鼻腔的定植菌,如果出现在痰培养中,不一定有意义,很可能是上呼吸道的定植菌,即使培养出再多,肺部没有相应的感染,它就不是下呼吸道的病原菌,某个菌是否为致病菌,一定是引起了与之相关的感染,如果不会分析,错把定植当致病菌,让真正的致病菌逍遥法外。

所有微生物工作者不仅要会做,还要会分析、审核报告,这才是是关键。要知其然和所以然,所以微生物人员除加强自身专业学习外,还要掌握了解与之有关的感染性疾病的和抗菌药物的相关知识,不仅懂微生物,还要懂临床,更要懂药学,才能提供精准服务,才能实现精准医疗。
   

  
所以说微生物是块难啃的硬骨头,下面再来看看,表皮葡萄球菌是个什么硬骨头?似乎人的身体到处都有它的影子。

表皮葡萄球菌是一类定植于人体皮肤和黏膜表面、腋窝 、头部、鼻孔等部位的血浆凝固酶阴性葡萄球茵。

图18

长期以来,表皮葡萄球菌都被定义为正常菌群。一方面可通过与潜在的病原微生物,如金黄色葡萄球菌竞争性定植于皮肤表面以发挥对宿主的保护作用;另一方面 ,它在某些条件下又可突破皮肤屏障进入机体并在留置医疗设备表面形成生物膜而导致感染,成为一种重要的医源性获得性感染条件致病菌。

近年来流行病学调查发现,美国每年因表皮葡萄球菌造成的人工留置静脉导管感染引发的血液感染病例250000例,死亡率高达25%。

图19

与大多数凝固酶阴性葡萄球菌一样,表皮葡萄球菌能形成生物膜,且导致的感染大都与生物膜的形成密切相关。表皮葡萄球菌的生物膜是嵌入到细胞外基质的蛋白吸附层与黏附其上的细菌簇形成的复合体,它构成了抗生素的渗透屏障,能保护菌体免受抗生素的破坏,因此是重要的防御结构。

图20

对大多数抗生素而言,需要使用更高的浓度才能杀灭附着在生物膜上的病原菌。表皮葡萄球菌生物膜抵御宿主防免疫系统,特别是先天性免疫系统的研究已见大量报。虽然近年来录到的因表皮葡萄球菌引起的感染病例越来越多,但一般仍认为其缺乏分泌性的毒素,致病力弱,主要是依靠在机体留置医疗设备(如人工留置静脉导管或植入人工关节)表面形成生物膜而造成慢性或亚急性感染。

去除感染因素后,一般病原菌会自动消除,但也有例外,需要抗菌药物的治疗才能消除病原菌。表皮葡萄球菌,除引起假体感染外,只要再无菌腔分离到,排除标本的污染,绝对有临床意义,曾经培养了一例眼睛房水的穿刺液,培养出很纯的表皮葡萄球菌,不是MRS是MSS,临床按照我们提供的药敏,患者炎症很快就消下去了,越来越多的文献报道,表皮是假体感染的重要致病菌。

因此我们要正确识别致病菌,不要一看见表皮就认为是污染,看见金葡就是致病菌,看看她们在存在的部位,是否引起了感染,具体部位具体分析。表皮葡萄球菌由于容易产生生物膜,对抗生素有很强的抵抗力,临床培养的的表皮多半是MRS,是重要的多重耐药菌株,多发生于免疫缺陷者,大面积烧伤,大手术后患者,长期住院及老年患者,MRS极易导致感染的流行和暴发。


MRS是什么?


本病例三次培养都是MRS。MRS—耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌:除甲氧西林耐药外,对其它所有与甲氧西林相同结构的β-内酰胺类和头孢类抗生素及其酶抑制剂,碳青霉烯类均耐药,新型的抗阳球的头孢地尔,头孢洛林除外),本病例还显示头孢西丁阳性,说明本菌还携带了mecA基因;mecA基因:编码产生青霉素结合蛋白PBP2a结构基因,由转座子携带并整合至葡萄球菌染色体的mec部位上的,mecA片段是葡萄球菌染色体上获得的外来片段,大约30kb ~ 50kb的染色体DNA。该片段只存在于耐甲氧西林的葡萄球菌中,敏感菌株中未发现该片段。

对于MRS的检测现在是苯唑西林和头孢西丁同时进行,以前只测苯唑西林,只要其耐药,就报告MRS,但是对macA,macC检测容易出现假阳性或者假阴性。头孢西丁比苯唑西林更适合测mrsa原因在于meca基因低水平表达时只有用头孢西丁诱导出来,而且macC基因存在时用苯唑西林检测时会是阴性,而头孢西丁检测会是阳性。

头孢西丁纸片法只适合金葡和路邓,不适合测假中间葡萄球菌,对表皮葡萄球菌以外的凝固酶阴性葡萄球菌建议苯唑西林mic在0.5-2时,建议测试mecA或pbp2a阴性报敏感。

图21

MRS传播主要通过医护人员的手,在患者、医护人员、患者间播散,另外,衣物、敷料等物品可携带MRS,促进MRS在院内的流行。病人一旦感染或携带MRS,该菌可存在于患者身上达数月之久,因此早发现、早治疗、早预防、合理使用抗菌药物,加强消毒制度,是降低MRS的关键。

来自: 检验医学网
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