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新冠病毒核酸检测“假阴性”的是是非非

面气灵 2020-2-26 138人围观 杂谈


为何没有将抗体检测纳入诊断标准?核酸检测方法的准确性又受到哪些因素的影响?到底不同方法学的诊断性能如何比较、对当前疫情防控的帮助有多大呢?


冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属,是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒,可分为α、β、γ、δ四个属。引发此次疫情的冠状病毒因2019年武汉病毒性肺炎病例而被发现,在2020年1月被世界卫生组织(WHO)命名为2019-nCoV,中文名称是“2019新型冠状病毒”,分类学属于冠状病毒β属,是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒。与其他致病性的RNA病毒类似,新型冠状病毒感染机体后,病毒的遗传物质—RNA是最先能被检测到的标志物。


IgM与IgG检测

随着感染后病程的发展,人体免疫系统会产生抗体,其中IgM是机体感染后产生的早期抗体,提示现阶段被感染的状态;而IgG则提示存在既往感染史。但是无论是IgM还是IgG,从病毒感染到抗体产生均存在窗口期,因此其检测往往滞后于核酸检测,在检测敏感度上也低于核酸检测。

CT检测

同样的,CT检测则必须在肺部已经产生炎症反应、引起组织器官发生器质性病变的情况下才能在影像学上呈现异常[2],而此时患者作为病毒携带者有可能已经向外界传播了大量病毒,因此CT检测在当前疫情防控极为紧迫的情况下具有一定的滞后性。

虽然《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》中新增了“疑似病例具有肺炎影像学特征者”作为湖北省临床诊断病例的标准,这也只是对大量患者等待确证、但由于各种因素无法及时完成核酸检测而不得已采取的办法;而且值得注意的是,即使在湖北省,影像学诊断也仅是“临床诊断病例”的标准,而非“确诊病例”的标准。

从早期确诊的角度看,病毒RNA检测是最优选择:

一方面是因为此时患者尚处于疾病的早期阶段,尽早检测对于疫情防控具有重要作用;

另一方面是核酸检测可以定量检测病毒的拷贝数,进而动态监测病毒感染的程度和治疗的效果。

理论上,核酸检测是能最早确诊新型冠状病毒感染的方法,但是如何保证核酸检测结果的及时性和准确性对当前疫情防控具有非常重大的意义,也是现阶段疫情防控的难题[3]因此,有必要论述一下引起当前新型冠状病毒核酸检测假阴性的可能原因。

一、非常时期国家监管的“绿色通道”

在我国,核酸检测试剂是按照三类医疗器械进行管理的。正常情况下试剂开发完成后,需经过临床试验确认结果的有效性后,再由国家药品监督管理局审批才能正式上市。但目前由于新型冠状病毒疫情的紧迫性,1月26日晚间,国家药品监督管理局启动应急审批程序,仅4d就批准了4种新型冠状病毒检测试剂上市,紧急应对当前疫情。

目前国内先后已有至少7种新型冠状病毒核酸检测试剂被批准上市。国家药品监督管理局的努力有效地缓解了疫情防控中试剂不足导致疑似病例无法尽早确诊的问题,但大量试剂的紧急上市不可避免地因产品质量问题和过度宣传等原因引发了一些负面评价,甚至出现了据称能十几分钟检测出结果、敏感度和特异度达到100%的过度宣传。

因此,如何保证核酸检测试剂质量的同时,规范核酸检测试剂的市场宣传,引导大众对检测试剂的正确认知,是当前疫情防控中的一个重要问题。此外,现阶段的新型冠状病毒核酸检测试剂均为应急性审批(注册证有效期为一年),最终还需要按照法规要求补充完成所有的临床验证才能延续注册,从而用于常规临床诊断。

二、大样本病毒基因组研究及临床验证的缺失

目前大多数新型冠状病毒检测试剂都是靶向新型冠状病毒的特定区域,通过RT-PCR扩增病毒的ORF1ab基因和N基因等进行荧光定量检测。

然而,新型冠状病毒属于RNA病毒,很不稳定,容易产生变异。现在针对该病毒的研究刚刚开始,病毒基因的变异频率如何、是否存在突变热点或进化上的保守区域都尚未可知。而在目前的情况下,试剂开发企业很难得到大规模临床样本进行试剂盒开发和临床验证。这就导致在试剂开发设计中只能根据有限的公开数据进行引物设计,但对大样本中的实际情况缺乏了解,只能在临床一线用了再说。

因此,在现阶段的特殊时期,这些试剂在临床应用之前无法保证必要的方法学验证,也很难排除大规模人群中存在个别样本由于扩增区突变导致假阴性的可能。如果能对已有的确诊病例数据进行一定程度的分析,确定可靠的核酸检测区域,而不是像现在这样由各个企业各自为战,那么检测结果的可靠性和一致性肯定会得到提升[4]

三、临床采样导致的误差

国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》中指出,在鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本中可检测出新型冠状病毒核酸。因为病毒性肺炎患者在下呼吸道具有更高的病毒载量,所以下呼吸道分泌物的检出率会更高一些[5],但获取肺泡灌洗液等下呼吸道样本操作上要求较高,且易喷溅,传播风险高,比较耗时。


患者从肺部深咳咳出的痰也属于下呼吸道样本,但对于已经出现症状的患者,特别是体质较弱的老年患者,往往只能从上呼吸道干咳咳出部分白痰,其检测价值就大大降低了。而且此时虽然机体启动了咳嗽反射,但很难将肺部深处的病毒或坏死物质排出体外,相反一部分病毒会随着干咳的飞沫排出体外,反而加重了病毒的传播。


在各种核酸检测样本采样中,鼻、咽拭子是最常用的采样方式,但是这类样本的病毒核酸检出率与病毒感染进程密切相关。

以甲流为例,一般在发病24~72 h内病毒在鼻、咽部的浓度达到高峰,然后迅速下降;一周左右快速抗原检测往往即呈阴性[6-7]。而目前对新型冠状病毒的病程转归并不完全清楚,采样的最佳时机仍不确认。尤其是该病潜伏期长,绝大多数患者就诊时可能已经迁延了数天至数周,是否是鼻、咽拭子检测的最佳时期,样本内病毒载量是否仍然在方法学的检测范围内还有待确定。

除了采样时机外,鼻、咽拭子采样操作也是影响检测结果的一个重要因素。标准的鼻咽拭子采样中,医务人员都要面对患者,将鼻拭子或咽拭子探入患者鼻腔或咽峡部接触式采样。部分患者受到拭子刺激后难免会出现咳嗽、喷嚏等应激反应,此时患者呼吸道内喷出的大量可能含有病毒飞沫的气体会直接喷射到采样医务人员的面部,对一线医务人员造成极大的危害。在巨大的感染压力下,也有可能会出现个别样本因为采样不彻底、不完全而导致的假阴性检测结果。

此外,采样的手势与采样的拭子材质对样本质量都至关重要。针对这一问题,中华医学会检验医学分会2020年2月4日在公众号上发布了标准的咽拭子采样教程,为临床一线标准化采样提供了规范。无论如何,在目前疫情非常严重的情况下,医务人员是在冒着极大的风险进行工作,为一线医务人员配备医用N95口罩、护目镜、手套、防护面罩以及防护服以确保其自身安全对于疫情的防控是非常重要的。

四、样本运输的限制

除了上述因素外,采样后样本的保存和运输同样会影响检测结果。各种RNA病毒的核酸由于自降解和生物酶介导的降解,是最难以稳定保存的生物分子之一。样本如何保存通常是决定RNA病毒样本质量的关键因素。

因此,含有RNA病毒的样本建议存放于专用的病毒保存液中,且必须在冷藏状态下(即4 ℃或更低温度)保存并尽快运输送检。新型冠状病毒作为一种新发现的RNA病毒,其储存、运输的要求可能更高,只有专业的医用物流机构才能保证样本运输的可靠性。然而目前绝大多数医院在样本采集后需要送至疾控中心统一检测,从采样到实际开展检测可能经过长时间的等待,采样医院以及开展检测的实验室是否具备专业的样本保存和低温运输能力,均是保证新型冠状病毒准确检测的重要因素。

五、试剂缺乏监控核酸提取质量的内标以及样本间、样本内重复

目前的检测试剂大多仅针对核酸提取后的检测,而对于RNA提取的方法以及质量未做明确说明;加入到体系内扩增的样本量也通常以体积而非RNA量来约定,这可能导致不同方法学提取的RNA质量良莠不齐、从而影响到最终的扩增效果。因此增加样本内标的扩增引物用于控制RNA 提取效率,可以有效控制因核酸提取质量欠佳导致的假阴性。

此外,按照目前试剂盒的说明书,针对一个患者大多都只是检测一个部位的样本、并只做一个反应,因此缺乏样本间、样本内的重复也可能是造成假阴性的原因。因此,增加同一患者不同部位的采样(例如同时采取鼻拭子和咽拭子样本)、利用不同试剂盒进行平行检测,可以有效控制因缺乏重复导致的假阴性。

新型冠状病毒肺炎已成为当前公众、社会、政府密切关注的事件。在应对引起本次肺炎疫情的新型冠状病毒上,广大的检验专家们也全力以赴,制定了详尽的生物安全和防护措施,为疾病诊断提供了各类检测手段与技术,尤其是核酸检测发挥了应有的技术优势,为病毒的早期诊断、疫情监测提供了可行的解决方案,也是确诊病毒感染最重要的依据。将核酸检测做到准确与快速,对大量疑似病例进行确诊是当下重要任务。

选择敏感度更高的核酸检测方法(例如数字PCR等技术),可以减少因RT-PCR自身敏感度不足导致的假阴性。但在目前绝大多数试剂均基于RT-PCR方法的现况下,保证试剂盒质量、规范采样/保存/运输流程、完善医院的实验室设备、提高检测人员的技术水平以及优化检测流程(例如增加样本内标控制RNA 提取效率、增加样本间样本内重复)等,都是提高新型冠状病毒核酸检测结果准确性的有效手段,也是目前疫情防控的关键。随着检测试剂上市的日益增多,有必要尽早信息资源共享,并进行多中心的性能评价,以明确某些灵敏度高、特异性好的试剂供医疗机构进行使用,这也是保障目前疫情防控的当务之急。
来自: 河北省人民医院检验科
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