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乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）是重要的抑癌基因，包括 BRCA1 和BRCA2。BRCA1/2 基因是评估乳腺癌、卵巢癌和其他相关肿瘤发病风险的重要生物标志物，也是影响患者个体化疗治疗方案选择的生物标志物，所以BRCA1/2 基因检测具有重要的临床意义。国内对BRCA1/2基因检测一般采用NGS(next-generation sequencing, NGS)，检测方法和解读要求缺乏标准化的规范与指导。为了建立基于NGS技术的BRCA1/2基因检测的方法学标准以及规范临床操作，该指南以中华医学会病理学分会组织2018年发表的《基于NGS技术的BRCA基因检测流程中国专家共识》为基础，经过相关领域的更新，更有效的进行遗传风险评估、治疗决策和预后判断，指导临床实践。
BRCA1 (A)and BRCA2 (B)structure and functions
来源：Targeting Tumor Suppressor Networks for Cancer Therapeutics[J]. Current Drug Targets, 2014, 15(1):-. 研究报道，约5%~22%的乳腺癌和15%~22%卵巢癌是由BRCA1/2基因突变导致的。BRCA1/2基因致病性突变使女性发生乳腺癌风险提高5倍，发生卵巢癌风险提高10~36倍。BRCA1/2基因突变还会显著增加前列腺癌、胰腺癌、男性乳腺癌、黑色素瘤等的发病风险。2.1 BRCA1/2基因突变与铂类化疗：铂类化疗药物通过引起DNA损伤破坏基因组稳定性，引起细胞死亡，被广泛应用于临床一线治疗各种肿瘤。BRCA1/2基因突变的癌细胞存在同源重组修复缺陷，影响DNA双链断裂修复过程，导致癌细胞对于诱导DNA双链断裂的化疗药物较为敏感。2.2 BRCA1/2基因突变与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［Poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］抑制剂的合成致死（synthetic lethality）效应：PARP是一种修复DNA单链损伤至关重要的酶，当PARP抑制剂选择性抑制PARP介导的DNA单链损伤修复途径时，未修复的DNA 单链损伤经过复制后将转化为DNA 双链断裂。正常细胞可通过同源重组修复DNA 双链断裂，然而在BRCA1/2基因突变的肿瘤细胞中，因为同源重组修复功能的缺陷，DNA双链断裂得不到修复，DNA损伤不断积累，最终导致细胞死亡，即合成致死效应。目前经美国FDA获批上市的PARP抑制剂药物包括Olaparib、Talazoparib、Niraparib及Rucaparib等分别适用于乳腺癌或其他癌种。2.3 BRCA1/2基因突变与相关肿瘤预后：肿瘤预后判断需要考虑多种临床病理及分子指标，对于卵巢癌，BRCA1/2基因突变状态是一个指示患者预后的重要因子，但在乳腺癌中仍需更多的证据来明确。综上，BRCA1/2基因检测可以有助于评估相关肿瘤的遗传易感性、制定相应的遗传管理措施（包括采取预防性手术、制定定期筛查方案、家属遗传风险评估等），还可以协助制定精准诊疗方案以及判断肿瘤患者的预后等。随着研究进展，BRCA1/2检测的适用人群会不断更新和拓展。新近的国内外权威指南和专家共识均推荐符合一定条件的肿瘤患者及高风险人群进行BRCA1/2基因突变检测。《美国国立综合癌症网络（NCCN）乳腺和卵巢遗传性/家族性高风险评估指南》（2019 V3版），具体如下：所有能够因基因检测而有可能受益于靶向治疗的BRCA1/2相关肿瘤患者（无论家族史情况，例如能够受益于PARP抑制剂的卵巢癌和转移性HER2阴性乳腺癌患者，能够受益于铂类化疗的前列腺癌患者等），不符合其它标准但有≥1位一级或二级亲属符合以上任何一条的个体（亲属分级见图），说明对于这类患者可能有更大收益。《NCCN卵巢癌、输卵管癌及原发性腹膜癌临床实践指南》（2019 V1版）。
推荐所有复发或者抵抗时的患者在开始治疗前进行肿瘤分子基因检测。验证试验须使用最近的肿瘤组织，在CLIA 批准的设施中进行。至少包括：BRCA1/2，同源重组通路基因、微卫星不稳定性或DNA 错配修复。![]() 《NCCN 乳腺癌临床实践指南》（2019 V1版）强烈推荐HER2阴性乳腺癌患者进行胚系BRCA1/2基因检测。![]() 《NCCN胰腺癌临床实践指南》（2019 V2版）推荐所有胰腺癌患者在确诊时接受遗传性肿瘤综合征相关的胚系多基因检测，包括BRCA1/2等；推荐局部晚期及转移性胰腺癌患者进行肿瘤/体细胞基因检测以发掘罕见但可用药的基因突变，包括BRCA1/2等；
![]() 《NCCN 前列腺癌临床实践指南》（2019 V2版）
《中国晚期上皮性卵巢癌维持治疗专家共识（2019版）》推荐初治卵巢癌患者在获得病理诊断后，复发或未控时，进行肿瘤分子检测，检测内容至少包括BRCA1/2基因、同源重组修复通路的相关基因、错配修复基因或微卫星不稳定性状态；《中国乳腺癌患者BRCA1/2基因检测与临床应用专家共识（2018年版）》推荐符合一定临床特征的乳腺癌患者进行BRCA1/2基因筛查，如发病年龄在40岁以下的乳腺癌患者，60岁以下的三阴性乳腺癌患者，所有男性乳腺癌患者，满足一定家族史条件的乳腺癌患者等；《中国前列腺癌患者基因检测专家共识（2019年版）》对一些特定的患者进行胚系检测，检测基因包括BRCA1/2等同源重组修复基因及其他DNA修复基因等。1.为评估遗传风险，建议对相关高风险人群进行遗传咨询及胚系BRCA1/2基因检测：来自于BRCA1/2 基因致病/可能致病突变家系中的个体；肿瘤检测发现BRCA1/2基因致病/可能致病突变但是不能明确是否为胚系突变的患者；所有新确诊的卵巢癌、输卵管癌及原发性腹膜癌患者；发病年龄在40 岁及以下的乳腺癌患者，发病年龄在60 岁及以下的三阴性乳腺癌患者，所有男性乳腺癌患者；所有新确诊的胰腺癌患者；高风险及以上、N1及M1前列腺癌患者，前列腺导管内癌患者；满足一定家族史条件的乳腺癌及前列腺癌患者；有1 个或以上1 级或2 级血亲满足上述检测标准的个体等（Ⅱ级推荐）a
所有新确诊的卵巢癌、输卵管癌及原发性腹膜癌患者进行胚系和/或体细胞BRCA1/2基因检测，复发后考虑使用新近获取的肿瘤组织进行BRCA1/2 基因检测（Ⅰ级推荐）；建议HER2阴性晚期乳腺癌患者在考虑化疗时进行胚系BRCA1/2基因检测（Ⅰ级推荐）；建议局部晚期及转移性胰腺癌患者在确诊时进行胚系和/或体细胞BRCA1/2基因检测（Ⅰ级推荐）；建议所有转移性去势抵抗性前列腺癌患者进行至少包含BRCA1/2等DNA损伤反应基因的胚系及体细胞变异的检测（Ⅱ级推荐）b。基于NGS技术的BRCA1/2基因检测流程可以概括为以下6个环节，即样本获取及处理、核酸抽提、文库构建、上机测序、下机数据分析以及变异解读，每个环节都应包括相应的质控步骤。
(一) 样本获取及处理：分为胚系突变和体细胞突变两种。胚系BRCA1/2基因突变起源于生殖细胞，存在于机体的每一个细胞中；体细胞BRCA1/2基因突变仅存在于肿瘤细胞中；肿瘤组织检测可同时获得胚系及体细胞BRCA1/2基因突变信息，但是对于突变检测阳性的患者需要进一步行胚系突变分析，以区分胚系及体细胞突变。1．新鲜穿刺组织：-80°保存，肿瘤细胞占比≥20%，≥50mg(手术大样本)，至少1针（手术小样本）；2．FFPE样本：肿瘤细胞占比≥20%，1年内蜡块或6周以内石蜡切片，≥5张（手术大样本），≥10张以上（穿刺小样本）；3．血液样本：2ml全血（EDTA抗凝管保存），15~35℃（运输保存）；5．口腔拭子：温开水漱口；无菌棉签轻擦颊粘膜10次；（二）核酸抽提及质控：原则上优先采用由国家药品监督管理局（National MedicalProducts Administration，NMPA）批准上市的试剂盒进行基因组DNA提取。在进行浓度和纯度测定时，可采用Nanodrop和Qubit等仪器；可采用琼脂糖凝胶电泳等方法对片段化程度进行评估。（三）文库制备及质控：基于扩增子的方法和基于杂交捕获的方法，检测区域需至少包括BRCA1/2基因整个外显子编码区及外显子与内含子交界区（±20 个碱基对）。文库质控文库定量一般采用Qubit，也可采用荧光定量PCR等方法，片段大小分析可采用Bioanalyzer 2100等。（四）NGS测序及质控：：构建好的文库将在高通量测序仪上进行上机测序，测序完成后，需对原始测序数据进行质控，一般参考Q30值。1. 流程及相关软件：包括数据比对、变异识别、变异注释等，数据分析流程中常用软件参考下表2. 生物信息分析质控：胚系BRCA1/2基因检测只需检测杂合突变或纯合突变，理论突变频率分别为50% 或100%；而肿瘤组织BRCA1/2基因突变频率可能很低。测
序深度推荐参考下表，并建议利用IGV等软件对变异进行可视化查看和确认。
（六）变异解读：变异分类建议参考国际癌症研究机构（IARC）分类，根据变异的致病性可分为五类：5类-致病性、4类-可能致病性、3类-意义未明、2类-可能良性以及1类-良性。数据解读的标准和规范以及数据解读和注释流程中常用数据库可参考《ACMG和美国分子病理学会（Association for MolecularPathology，AMP）序列变异解读标准和指南（2015版）》和《BRCA 数据解读中国专家共识》。BRCA1/2基因检测报告可参考《BRCA1/2数据解读中国专家共识》。（七）验证：主要包括优化实验条件与分析参数、建立整个实验流程的操作规范（protocol）、制定性能规范和质控程序、评估NGS与其他检测方法检测结果的一致性以及使用数量和类型合适的样本进行性能验证或确认等。（八）大片段重排（large genomic rearrangement，LGR）的检测：多重连接探针扩增技术（MLPA）是目前应用最广泛的LGR检测方法。（九）BRCA1/2基因检测的临床路径：胚系BRCA1/2基因检测样本包括血液或唾液等，以血液样本为主。对于优先选择肿瘤组织进行检测的患者，当肿瘤NGS检测结果为阳性时，建议采集血液或唾液等样本进行胚系BRCA1/2检测（可采用Sanger测序等方法）以明确该突变是否为胚系突变。肿瘤或胚系NGS检测结果（点突变，小片段插入缺失）为阴性时，可进行LGR检测以进一步明确是否含有BRCA1/2基因的大片段重排变异（尤其有相关肿瘤家族史的人群）。a高风险人群的界定参考前文或《美国国立综合癌症网络（NCCN）乳腺癌和卵巢癌遗传性/家族性高风险评估指南》（2019 V3版）。 b《中国临床肿瘤学会（CSCO）诊疗指南证据类别（2018）》 1A类证据：基于高水平证据[严谨的Meta分析或随机对照临床研究(RCT)结果]，专家组有统一共识；
1B 类证据：基于高水平证据(严谨的Meta 分析或RCT 结果)，专家组有小争议； 2A类证据：基于低水平证据，专家组有统一共识；2B 类证据：基于低水平证据，专家组无统一共识，但争议不大； 3类证据：专家组存在较大争议 《CSCO诊疗指南证据类别（2018）》 Ⅰ级推荐：1A 类证据和部分2A 类证据； Ⅱ级推荐：1B 类证据和部分2A 类证据； Ⅲ级推荐：2B 类证据和3类证据；不推荐/反对）。 对于整个从样本到报告的过程，该指南做了详尽的介绍。但是，如果我们检测到了一个BRCA的突变位点，如何将它分类，怎么知道它的致病性呢？目前，BRCA变异解读最权威的指南或标准包括：ACMG和美国分子病理学会（Association for Molecular Pathology，AMP）序列变异解读标准和指南（2015版）， 欧洲分子基因诊断质量联盟 （EMQN）遗传性乳腺癌/卵巢癌分子遗传分析最佳实践指南（2008版） 和ENIGMA BRCA1/2 基因变异分类标准（1.1版），综合以上指南，2017年《BRCA数据解读中国专家共识》就BRCA基因特征总结出以下规则，以此报告为例：变异的致病性可分为五类：5类-致病性、4类-可能致病性、3类-意义未明、2类-可能良性以及1类-良性。1.报告会根据测序结果先给出检测结果，包括：基因、BRCA评价、cDNA改变、蛋白改变、纯合/杂合、变异解读。其中，基因、cDNA改变、蛋白质改变及纯合/杂合这些内容都是可以通过NGS测序技术及分析结果得到，但是变异解读则需要综合判断了。变异解读的结论则是来自结果说明的整体评定，每一条证据判断都应有所根据。 2.1 致病性（pathogenic）-5类：编码提前终止密码子的序列变异；发生在剪切位点即外显子上下游第一或第二个碱基的变异，但是，需除外经预测或已明确的可产生可能恢复BRCA1/2基因功能的自然存在的框内RNA异构体的变异 ；拷贝数缺失变异；任意大小的拷贝数重复变异；体外或体内功能研究显示对基因或基因产物有破坏作用且与肿瘤高危相关的其他类型变异。2.2 可能致病性（likely pathogenic）-4类：该变异经mRNA水平的实验证实能够改变剪接，但是不会产生可能恢复基因功能的自然存在的框内RNA异构体；该变异编码的氨基酸改变与之前定义的5类致病性错义突变相同，但发生改变的基础核苷酸不同，而且既往疾病关联并非由剪接事件所致...；移除密码子的小片段框内缺失变异；体外或体内功能性研究显示对基因或基因产物有破坏作用的其他类型变异2.3 意义未明（uncertain significance）-3类：证据不足以将其归类为1、2、4 或5 类的变异，或证据与良性和致病性分类相矛盾的变异。2.4 可能良性（likely benign）-2类：该变异编码的氨基酸改变与已确认的１类良性变异相同，但发生改变的基础核苷酸不同，且无证据表明该变异会导致剪接事件；个体发生的胚系变异与已知致病变异在同一基因上呈反式（in trans）排列，且该个体除了BRCA相关肿瘤外无明显其他临床表征。2.5 良性（benign）-1类：外显子组测序项目、千人基因组计划或外显子组整合数据库中等位基因频率>５％ 的变异；体外或体内功能研究显示对蛋白质功能或剪接无破坏作用的变异。检测结果部分应列出在该被检测者中发现的所有2~5类基因变异和总体BRCA状态。此外，基于NGS的检测方法，因测序深度等原因，样本中检出的大片段重排（如CNV）可能会出现假阳性的结果。为了避免这些情况，仍需通过Sanger测序或MLPA探针技术对阳性结果进一步确认。此外，不同的机构对BRCA1/2的解读进行了一定程度的归类，使得解读能够更加准确更加清晰。目前，杭州联川基因诊断技术有限公司分析BRCA1/2突变以此共识为基础，对上述的五类变异进行了更加细致的分类，并借鉴ACMG遗传变异的打分机制，对各类证据做了深层次归类，结果更加合理准确。同时，联川生物BRCA检测试剂盒产品、BRCA1/2检测及解读已广泛应用于临床诊断，力求为客户提供最准确的解读和最优质的服务。
VariantBaits™ Target Enrichment System 液相杂交捕获系统
基于自主知识产权μParaflo® 微流体芯片平台合成RNA捕获探针，采用液相杂交技术捕获靶标DNA，使用生物素标记探针诱饵，探针序列与靶向序列互补，完成靶向序列文库的富集与制备。可用于从小到大规模的基因捕获，容忍某些局部模板的变异。 VariantPro™ One-Step Multiplex PCR System 一步式多重PCR建库系统 经过LC Sciences科学家两年潜心攻关，于2015年成功研发出VariantPro™一步式多重PCR建库系统，在目标区域进行引物设计，通过多重PCR的方式进行目标区域扩增，通常不受引物间模板变异的影响。文库制备可简化成一步，人工操作时间仅5分钟，可用于小到中规模的基因捕获。 |
