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荧光定量 PCR 技术在产前诊断中的应用专家共识

笔者苏洛 2018-9-7 02:42 PM 2440人围观 医学

作者:荧光定量 PCR 技术在产前诊断中的应用协作组

选自:中华妇产科杂志 2016 年 5 月第 51 卷第 5 期 第321-324页

自 2002 年起,我国启动了以唐氏综合征等常 见染色体异常为主要目标疾病的产前筛查及产前 诊断,染色体核型分析技术是确诊的“金标准”。染 色体核型分析技术准确、可靠,但以手工操作为主, 需要进行细胞培养,存在耗时长、检测通量低、需培 养专业人员及实验室建设周期长等诸多问题,已难 以满足日益增长的临床产前诊断需求。
近年来,分子遗传学诊断技术发展迅速

荧光定量 PCR(quantitative fluorescent polymerase chain reaction, QF-PCR)技术、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术、多重连接探针扩增(multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)技术、实时(real time)荧光 PCR 技术、染色 体 微 阵 列 分 析(chromosomal microarray analysis, CMA)技术、产前液相芯片(BACs-on-Beads, BoBs) 技术、无创性产前基因检测(noninvasive prenatal testing, NIPT)等已逐渐成熟,并开始向临床转化。 分子遗传学诊断技术多以遗传物质 DNA 为检测对 象,不需要进行细胞培养,为传统的细胞染色体核 型分析技术提供了有效的补充。


       QF-PCR 技术是通过检测遗传标记短串联重复 序列(STR)进行染色体异常的产前诊断,由 Adinolfi等于 1995 年建立。一定人群中每个 STR 基因座有 数个至数十个的等位基因,而每个个体 STR 基因座 的等位基因数量与染色体数目具有对应关系。QF-PCR 基于 PCR 扩增和毛细管电泳分离技术,通 过定性、定量分析 STR 的多态性,能诊断出99.2%~100.0%目标染色体(21、18、13、X 和 Y 等 5 种 染色体)的非整倍体异常[1-4];除此之外,还能检测出 三倍体和母体细胞污染[5],以及根据 STR 等位基因 的个性化信息判别多余染色体的父亲或母亲来源, 为临床提供更多的遗传信息。与其他分子诊断技术相比,QF-PCR 技术可半自动化和批量检测,24~48 h 内能得到结果[6],在高通量检测、价格低廉[7]、可 质量控制等方面具有突出优势,有望解决产前诊断 技术资源的“缺口”问题。

       QF-PCR 技术是快速靶向分子诊断技术,主要 针对 21、18、13、X 和 Y 共 5 种染色体的数目异常,不 能检测出所有的染色体异常。QF-PCR 技术对高风 险染色体异常(可导致异常临床表现)的漏诊风险 是临床应用研究中关注的重点。Speevak 等[4]发现, 在所有的产前诊断适应证下,QF-PCR 技术能检测 出 98.5%的高风险染色体异常,如果把超声检查结 果异常的适应证排除在外,则可以检测出 99.92%的高风险染色体异常。

2004 年,英国国家筛查委员会(UK National Screening Committee, UKNSC)建议,在产前诊断中 可用 QF-PCR 或 FISH 技术取代染色体核型分析技 术;2005 年 4 月,英国临床细胞遗传学和临床分子 遗传学协会(Association for Clinical Cytogenetics and Clinical Molecular Genetics Society, ACC-CMGS) 发布了第 1 版的 QF-PCR 应用指南[8],2012 年又推出 了新版[8]。近年来,世界其他地区的实验室也陆续 进行了 QF-PCR 技术产前诊断的研究,并基本达成 共识:在明确诊断适应证的情况下,即当胎儿超声 检查未显示结构异常、且孕妇无染色体异常家族史 时,QF-PCR技术能可靠地用于常见染色体异常的 产前诊断,有助于降低染色体核型分析检测量、减 少产前诊断费用、缓解孕妇及家属的等待焦虑[9-11]。

QF-PCR 技术在国外已有较广泛的应用,但目 前尚未在国内产前诊断临床中普遍开展。为规范 使用 QF-PCR 技术,由国家卫生和计划生育委员会 召集、中国医学科学院北京协和医院产前诊断中心 主办的“全国产前筛查与诊断技术管理规范编制研 讨会”于 2015 年 11 月 14 日在成都召开,会议就QF-PCR 等快速产前诊断技术的临床应用进展及其 在国内应用中存在的具体问题进行了深入而广泛 的探讨,并形成了 QF-PCR 技术在产前诊断中的应 用专家共识。


一、QF-PCR 技术临床应用的适应证 

1. QF-PCR 技术单独用于产前诊断的指征:

(1)常规产前筛查提示染色体非整倍体高风险的孕 妇或高龄孕妇(需告知局限性):有常见染色体非整 倍体产前诊断需求,无既往不良孕产史,超声筛查胎儿结构未发现明显异常。

(2)NIPT 高风险孕妇:已采用针对 21 三体、18 三体、13 三体等常见染色体 非整倍体的 NIPT 筛查,提示高风险,需要明确诊 断者。

2. QF-PCR 与其他细胞遗传学分子诊断技术联用的指征:

(1)QF-PCR 与染色体核型分析技术联合应用于染色体异常的产前诊断:染色体核型分析技 术通常需要 2~3 周的时间发出报告。QF-PCR 与 染色体核型分析技术联合应用,有助于早期诊断常 见染色体异常,使临床能早期处理异常胎儿,并有 助于缓解孕妇及家属的等待焦虑。适用的产前诊 断指征包括:产前筛查高风险,高龄孕妇,超声检查 示胎儿异常且提示为 13、18、21、X、Y 等染色体数目 异常等。

(2)QF-PCR 与其他细胞遗传学分子诊断技术同时应用:QF-PCR 技术检测的是样本 DNA 而不是 活体细胞,所需样本量少,方便应用。在临床应用 其他细胞遗传学分子诊断技术时,可同时应用QF-PCR 技术获得 13、18、21、X、Y 等染色体数目的 信息,有助于排除常见染色体异常情况,辨别是否 存在母体细胞污染,或对其他分子诊断技术的检测 结果进行验证等。其指征包括:1在进行单基因遗 传病分子诊断时,应用 QF-PCR 技术检测常见 5 种 染色体的数目异常;2在产前诊断操作中疑有母体 细胞污染时,利用 QF-PCR 技术检测的 STR 多态性 信息辨别采集的胎儿标本中是否混有母体组织细 胞;3当其他用于常见染色体数目异常诊断的分子 诊断技术(如FISH)的结果异常或不明确时,可采 用 QF-PCR 技术进行验证。

二、QF-PCR 技术在产前诊断应用中的相关问题

1. 不同的标本类型及处理建议:

QF-PCR 技术检测可采用各种类型的产前标本。所需要的标本 量 为 羊水 1~5 ml,或绒毛 0.2~2.0 mg,或脐血 0.2~2.0 ml。需注意的是,(1)羊水标本离心后如肉眼可 见红色血液污染,则需将羊水标本同孕妇外周血标 本同时检测,判断有无母体细胞污染;(2)所有的绒毛标本均需将胎儿标本同孕妇外周血标本同时检 测,以排除母体细胞污染;(3)由于局限性胎盘嵌合 体现象的存在,绒毛标本的细胞可能嵌合有正常及 异常核型的细胞,采用绒毛标本提取 DNA 时应尽 可能使用多条绒毛的混合细胞提取核酸;(4)如果 绒毛标本经 QF-PCR 技术检测出染色体三体,而胎 儿又无其他临床征象提示异常则建议对绒毛标本 进行染色体核型分析,或抽取羊水进行 QF-PCR 技 术检测。

2. 关于 QF-PCR 技术检测试剂:

建议采用已注 册的商品化试剂盒进行 QF-PCR 技术检测,按试剂 盒说明书进行染色体非整倍体异常的诊断。参考ACC-CMGS 指南[8],试剂盒所采用的 STR 基因座应 在所应用的人群中具有高度的异质性和多态性。 其 中,常染色体和 X 染色体的检测基因座应至少有4 个,Y 染色体特异性检测基因座至少两个(建议包 含 SRY 基因座),同时应包含能反映 X 染色体、Y 染 色体数量比例的基因座(如 AMEL 基因座);建议加 用1个X染色体计数基因座,如TAF9b基因座(同 时位于 3 号染色体短臂和 X 染色体长臂上),当 Y 染 色体缺如时可以对 X 染色体计数。

3. 特殊染色体数目异常的诊断:

(1)关于 X 单 体的诊断: 如 Y 染色体特异性检测基因座(如 SRY) 未出现基因型,并且其余性别基因座均显示为单等 位基因型,可初步考虑X单体高风险;确诊需要结 合X染色体计数基因座(如TAF9b)的检测。需注 意:性染色体的多态性检测(即 STR 检测)对单体而 言只是筛查不是诊断,特别是当 STR 使用数量较少 或家族具有同族血缘关系时假阳性风险更高。确 诊必须采用 X 染色体计数基因座,如果没有,则需 应用其他产前诊断技术进行确诊或在出具的报告 内说明局限性。

(2)关于染色体三体的诊断提示: 超过两条染 色体的 STR 出现三等位基因型,其他染色体的 STR检测无与之矛盾的结果,提示可能存在染色体三 体,可采用其他产前诊断技术进一步验证。

(3)关于三体嵌合体的诊断: 当某染色体上有 单个或多个 STR 出现多余等位基因(三体最多出现3 个等位基因),应注意观察是否存在嵌合体。QF-PCR 技术一般可检测出嵌合比例在 20%及以上 的三体嵌合体。

4. QF-PCR 技术检测结果的应用:

QF-PCR 技术 检测结果异常,可单独出具诊断报告,以便临床早 期处理异常胎儿;QF-PCR 技术检测结果未显示异常,不排除存在目标染色体以外的其他染色体异 常,应在报告中告知 QF-PCR 检测的局限性和存在 其他染色体异常风险等情况。

三、产前遗传咨询的相关问题


       QF-PCR 技术的优势在于快速、高通量检测、适 用于多种标本类型,在产前诊断领域有广泛的适用 性。但 QF-PCR 技术为目标靶向检测,存在技术固 有的局限性。表现在:(1)不能检测出目标范围外 的其他染色体异常;(2)无法可靠地检测出低于20%的嵌合体。在进行 QF-PCR 技术检测前应告知 孕妇 QF-PCR 技术的优势与局限性,并签署知情同 意书,在检测后应结合孕妇的临床情况(如胎儿超 声检查情况)进行遗传咨询。

四、QF-PCR 技术在产前诊断中的规范化应用

1. 产前诊断技术资质:

QF-PCR 技术临床检测 项目应在有产前诊断资质的医疗机构中开展。项 目申请的要求参照我国卫生行业标准《胎儿染色体 异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术 标准》(WS 322.2-2010)。申请 QF-PCR 技术检测的 医师应是经过产前诊断专业培训的、有资质的医师。

2. 产前遗传咨询资质: 

在进行产前 QF-PCR 检 测前和检测后,必须对孕妇及家属进行相关的产前 遗传咨询。根据 2002 年颁发的《产前诊断技术管 理办法》的有关规定,从事产前诊断技术的卫生专 业技术人员,必须经过系统的产前诊断技术专业培 训,通过省级卫生行政部门的考核并获得从事产前 诊断技术的“母婴保健技术考核合格证书”。

3. 签署知情同意书: 

在进行产前 QF-PCR 技术 检测之前,必须与孕妇有充分的知情谈话,需说明QF-PCR 技术检测的内容、风险和技术局限性,并签 署相关的知情同意书。

4. 标本采集:

参照卫生行业标准《胎儿染色体 异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术 标准》(WS 322.2-2010)进行标本采集。

5. QF-PCR 技术的实验室检测: 

QF-PCR 技术检 测应在获得体外基因扩增检测资质的 PCR 实验室 中进行。实验室应配备毛细管电泳仪、PCR 扩增仪 等相应的实验设备,并建有实验操作技术文件;实 验室操作人员应经过体外基因扩增检验实验室技 术的专业培训并获得许可资质;出具诊断报告的人 员应是具备产前诊断资质的医师,并经过 QF-PCR技术的相关培训。

6. QF-PCR 技术检测报告的应用: 

出具 QF-PCR技术检测报告时,应在报告中明确说明检测结果的提示意义与局限性。


◆  ◆  ◆  ◆  ◆  

       QF-PCR 技术虽然不能检测完整核型,但对21 三体、18 三体、13 三体及性染色体的数目异常而言,是 1 项性价比较高的产前分子遗传学诊断技 术,有良好的应用前景。在产前筛查蓬勃发展,而 国内产前细胞染色体核型分析诊断资源不足的情 况下,规范应用 QF-PCR 技术有助于缓解细胞染色 体核型分析供不应求的矛盾,也有助于加强我国染 色体异常出生缺陷二级预防的力量,完成常见染色 体非整倍体异常的产前诊断,希望在降低严重缺陷 儿出生率、提高出生人口素质等方面发挥出积极的社会意义和经济意义。

荧光定量 PCR 技术在产前诊断中的应用协作组专家成员:

边旭明 (中国医学科学院北京协和医院)、

王和(四川大学华西第二医院)、

邬玲仟(中南大学医学遗传学国家重点实验室)、

胡娅莉(南京大学 医学院附属鼓楼医院)、

廖世秀(河南省人民医院)、

刘俊涛(中国医 学科学院北京协和医院)、

廖灿(广州市妇女儿童医疗中心)、

朱宝生(云南省第一人民医院)、

吕时铭(浙江大学医学院附属妇产科医院)、

王华(湖南省妇幼保健院)、

许争峰(南京市妇幼保健院)、

杨慧霞(北京大学第一医院)、

徐两蒲(福建省妇幼保健院)、

王治国(国 家卫生计生委临床检验中心)、

蔡艳(济南市妇幼保健院)、

戚庆炜(中国医学科学院北京协和医院)、

朱宇宁(浙江大学医学院附属妇 产科医院)、

尹爱华(广东省妇幼保健院)

本共识执笔专家:

朱宇宁(浙江大学医学院附属妇产科医院)、

吕时铭(浙江大学医学院附属妇产科医院)

来源: 妇产科空间
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