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逆转录常见问题与解决办法

归去来兮 2024-5-20 03:52 PM 188人围观 技术


1

可以通过测逆转产物cDNA浓度判定逆转效率吗?


不可以。逆转录产物cDNA是混合物,除了cDNA产物以外,还有buffer、逆转录酶、引物,同时还包含未转录的模板RNA,总RNA中的tRNA、rRNA等,都会干扰浓度测定结果,因此不能反应真实的cDNA产量。


2

如何检测RNA逆转录成功与否?


1) 内参法:理论上,逆转录的cDNA是长度不同的DNA片段,所以电泳条带应该均匀分布在泳道上,如果RNA丰度低,电泳检测也可能无产物,这种情况通过PCR扩增内参基因,如果有扩增产物,cDNA的质量基本上可以保证(少数情况下:如目的基因片段过长,可能会有例外)。


2) 已知基因扩增法:如果有已知以此模板扩出来的基因,可以用此基因的引物验证。能扩增出内参,不一定就说明cDNA没有问题。因为内参在cDNA中丰度高,容易扩增。如果cDNA因为各种原因导致部分降解,则会大大影响低丰度的目的基因的PCR结果,而内参因为是高丰度基因,扩增很可能不受影响。


3

逆转录产物中存在gDNA对后续qPCR实验有何影响?


当cDNA产物中混有gDNA时,cDNA和gDNA在qPCR反应时会被同时扩增,无法区分荧光信号是来自于cDNA还是gDNA,因此定量结果可能会存在偏差。特别是低表达量的基因,本身的扩增信号低,Ct值大,更加容易受到gDNA污染的影响。在逆转录的时候,加一步gDNA去除的步骤,能够有效降低gDNA污染的影响,增加实验的可信度。


4

逆转录时,如何选择逆转录引物?


逆转录引物有三类,分别是oligo(dT)、随机引物(Randomer)和基因特异性引物(Gene-specific primer,GSP)。


1) Oligo(dT)


是一种由T碱基组成的引物,因绝大多数真核细胞的mRNA 3’端具有Poly(A)尾(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有Poly(A)尾),Oligo dT结合在Poly(A)尾上与其配对,从头逆转,得到的cDNA更长更完整,但对 RNA 样品的质量要求较高,少量的降解会使全长cDNA合成量大大减少。当下游实验为普通PCR扩增,需要进行全长第一链 cDNA 合成,且模板为真核生物来源,逆转录反应推荐使用Oligo(dT);


2) Randomer


即随机六寡核苷酸引物:包含6个碱基的任意组合,可随机结合在RNA链上的任意6个碱基,随机结合到模板RNA的任何区域,能够逆转录更多的RNA,因此得到的cDNA产量更高;尤其在靶RNA序列很长或包含较多二级结构,使用Oligo(dT)不能有效引导cDNA合成时,使用随机引物是较为有效;同时适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的逆转录反应。当目标区域具有复杂二级结构或模板为原核生物来源时,逆转录反应推荐使用Randomer ;


3) Gene-specific primer,GSP


结合特定的基因序列,可按要求自行设计合成,与模板序列互补,适用于基因表达量低、序列已知的基因逆转录。一般主要用于一步法RT-PCR反应。


当cDNA后续进行qPCR,建议将随机引物与oligo dT引物结合使用,可以大大提高逆转录效率及后续qPCR的灵敏度,避免3’端和5’端的扩增偏好性。


5

逆转录后,RT-(q)PCR扩增量低或未扩增?


1) RNA完整性低


合成cDNA前,通过凝胶电泳或微流控芯片技术对RNA完整性进行评估。


尽量减少RNA样品反复冻融的次数,以防止降解。


遵守实验室的最佳操作惯例,以避免RNase污染。


在建立逆转录反应时加入RNase抑制剂


使用确认无核酸酶或DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的水,以确保无RNase。


将RNA存储于EDTA缓冲溶液(0.1mM的EDTA,或10mM的Tris+1mM EDTA)中,以尽量减小由具有金属离子辅酶因子的核酸酶造成的非特异性裂解。


在灭活/去除所使用的DNA酶的过程中,选择对RNA完整性的影响最小的基因组DNA去除方案。


考虑使用对已降解的RNA样品高度有效的逆转录酶。


2) RNA纯度低


遵循特定来源(组织、血液和植物)样品RNA纯化方案。


通过UV光谱法,读取一定波长范围的吸光度,评估RNA的纯度。


检查RNA提取步骤。避免超过源材料推荐的用量,使样品充分裂解并尽量减少抑制剂残留。确保洗涤步骤正确,以除去杂质和抑制剂。


如有必要,在无核酸酶水中稀释起始RNA,以降低潜在的抑制剂浓度。


如有必要,重新纯化RNA样品,以除去残留的盐和抑制剂。


考虑使用耐受盐、残留生物抑制剂和提取试剂的抑制效应的逆转录酶。


3) GC含量高或二级结构


在逆转录之前,在65℃加热RNA 5min,使二级结构变性,然后在冰上迅速冷却。


通过在较高的温度下(例如50℃)进行逆转录以最小化发夹序列形成的可能。


使用能够承受高反应温度的热稳定逆转录酶。


4) 低RNA量


检查起始RNA的推荐用量方案。通过紫外光谱确定RNA量。为获得更高精度和特异性,可考虑选择基于荧光定量的方法。


在灭活/去除所使用的DNA酶的过程中,选择对RNA完整性影响最小的基因组DNA去除方案。


使用高效率、高灵敏度的逆转录酶,以逆转录低丰度RNA。


选择在宽的起始RNA量范围内可获得高度线性的逆转录试剂,以确保可以准确定量低丰度RNA。


5) 不理想的逆转录酶


为了提高cDNA的得率,选择具有更高灵敏度、持续合成能力、和耐受抑制剂的高效逆转录酶。高效逆转录酶非常适合于具有挑战性的RNA样品,如已降解或含抑制剂的样品。


对于较短反应时间和较高反应温度的实验,分别使用具有高持续合成能力和高热稳定性的逆转录酶。


6) 逆转录未达到理想时间和温度


确保反应时间和温度适合于所选的逆转录酶。


7) 不正确的引物设计


针对特定的RNA模板,查看关于逆转录引物类型的建议。例如对于细菌RNA或缺乏poly(A)尾的RNA,以及可能降解的RNA,使用随机引物代替寡核苷酸(dT)引物。


对于基因特异性的引物,确保引物的序列与靶序列的3' 端互补。


8) 反应组分的质量(或稳定性)


遵循制造商的建议存储和使用试剂。


确保使用的试剂为新鲜配制,并适于所选择的逆转录酶。


混合试剂能完全溶解,可能已经沉淀的DTT和盐。



本文编辑:小薇


来源: Super Lab
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