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核酸降解知多少?

归去来兮 2024-4-22 03:40 PM 303人围观 技术


在实验过程中,最心累的莫过于好不容易提取的核酸却降解了。那么核酸为什么会发生降解呢,我们又该如何预防呢?关于核酸降解,你了解多少呢?让我们一起对核酸降解一探究竟吧。


什么是核酸


核酸是一种高分子化合物,核苷酸是构成核酸的基本单位。核酸水解后得到许多核苷酸,核苷酸是组成核酸的基本单位,即组成核酸分子的单体。

一个核苷酸分子由一分子含氮碱基、一分子五碳糖和一分子磷酸组成的。根据五碳糖的不同可以将核苷酸分为脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。

核酸降解是DNA/RNA分子中的碱基和戊糖间的氮糖苷键,或磷酸二酯键在物理因素、化学因素和生物因素等作用下发生水解,使DNA/RNA链发生断裂。


核酸降解原因


DNA降解的因素很多,主要分为物理因素,化学因素和生物因素。

一、物理因素:温度,机械剪切力、核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等。

二、化学因素:PH值,水解反应,氧化反应等。

三、生物因素:酶解及微生物侵染等作用。


一、物理因素的影响


★ 温度:高温条件下,RNA不稳定,易加速磷酸二酯键的水解,使核酸降解;

★ 机械剪切力:包括剧烈震荡、搅拌、细胞突然置于低渗溶液中,以及让溶液快速通过狭长的孔道;

★ 核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等,均会导致核酸的降解。


二、化学因素影响水解


★ PH值:氢离子参与催化磷酸二酯键、糖苷键的水解,但糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解。过高或过低的PH值都易破坏复键。核酸(特别是RNA)在碱性溶液中十分容易降解;

★ 氧化反应:会氧化碱基中的含氨杂环,使其变性,从而改变一级与二级的核酸构象;

★ 苯酚在空气中被氧化生成醌,它能够产生自由基,直接用于DNA的分离,会使磷酸酯键断裂,造成DNA的降解。


三、生物因素影响


★  酶解:核酸酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键,直接破坏核酸的一级结构,使其降解。

核酸酶(磷酸二酯酶) 核酸内切酶:在环境或生物体内具有识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链的核酸内切酶统称为限制性核酸内切酶。作用方式从多聚核苷酸链中间开始,在某一个位点切断磷酸二酯键。如DNase,RNase等。


核酸外切酶:核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端(3'-端或5'-端)开始,逐个水解切除核苷酸。如蛇毒磷酸二酯酶,牛脾磷酸二酯酶等。

核苷酸酶(磷酸单酯酶) 专一性的磷酸单酯酶:3'-核苷酸酶,5'-核苷酸酶 非专一性磷酸单酯酶。

★  微生物侵染:微生物会将DNA作为营养物质或是其分泌的化学物质含酶。


预防降解的方法


预防RNA降解的方法:

★ 去除环境中RNase酶的污染或强有力地抑制其活性。

★ 获取样品后最好立即提取RNA,若无条件立即实验,应于-80℃液氮中保存样品,提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞,以防RNA降解。

★ 所用的试剂、耗材需要用DEPC水浸泡然后高压灭菌。

★ 在总RNA提取分离的最初阶段,联合使用Rnase的特异抑制剂,尽可能的灭活胞内的Rnase的活性。

★ 避免样品的反复冻融。

★ 保证裂解液的质量,裂解液的用量不足,也会导致RNA降解。

★ RNA提取后,放入-80℃保存,防止降解。

预防DNA降解的方法:

★ 简化操作步骤,缩短提取过程,以减少各种有害因素对核酸的破坏;

★ 减少化学物质对DNA的降解,为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏;

★ 防止基因组DNA的生物降解,主要是DNase降解基因组DNA,Dnase需要二价金属阳离子Mg2+等的激活,可用EDTA等金属离子整合剂整合Mg2+以抑制Dnase的活性;

★ 减少物理因素对DNA的降解,物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈震荡、搅拌等);

★ 避免样品的反复冻融,可将DNA分装保存于缓存液中;

★ 所有试剂应用无菌水配制,耗材经高温灭菌;

★ 避免DNA的过高温处理等。

来源: Gene Diagnosis
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