一文讲透酶标仪

你相信“光”嘛！

光是电磁波，波长100nm-400nm称为紫外光，400nm-780nm之间的光可被人眼观察到，大于780nm称为红外光。人们只所以能够看到色彩，是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。

酶标仪，即酶联免疫检测仪，用来检测ELISA反应后的吸光度值，主要由光路系统与信号采集系统组成。工作原理为：

光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上；

光电检测器将光信号转换成相应的电信号，经过一系列信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后显示结果。

分为滤光片式酶标仪（固定波长酶标仪）、光栅式酶标仪（全波长酶标仪），这两种都是属于光吸收酶标仪；

滤光片是光学玻璃片镀制光学膜层，使滤光片对通过的波长发生变化，将不需要的波长光隔开。根据选配的滤光片，只能截取特定波长进行检测。

光栅型是使用物理性衍射光栅原理在不同角度将白光光源分开，再通过一系列狭缝将已选取的激发波长分出来。光栅型酶标仪可以截取光源波长范围内的任意波长，灵活度更高。

目前滤光片系统因价格较为便宜，检测灵敏度高，带宽的可选择性强，可以进行快速的滤光片切换等优点，其应用更广。

a、酶标仪光的纯度区别比较

     光电检测以采用纯度高的光为佳，但不管采用哪种分光器，都不可能得到绝对纯的光。

     光栅：就光栅分光后的一点而言，光是纯的，但由于透光孔具有一定宽度，比色皿所接受的光，是一个在指定波长附近波段上的等强的光。

     滤光片：经滤光片分光后，通过透光孔被比色皿所接受的光也是一个波段，但在指定波长上光的强度最高，呈正态分布。

b、酶标仪光的稳定性区别比较

    光栅：棱镜或者光栅片的绕轴旋转，由于不可避免的机械误差，并且小角度的偏差经过2-3次反射，会造成很大的偏差，造成波长的不稳定。另外光栅是窄缝，其能量也会很弱，小的检测电压信号为了获得大的电压值，必须以大倍数放大，这样误差也会被放大，会造成检测的不稳定

    滤光片：由于从同一滤光片上每一点透过的光的波长都是相同的，每个位置是通过光偶准确定位，不受仪器本身机械误差的影响，所以，光强经会聚后，能量很高，电压信号也会相对强，主流光很强，其它杂光的影响就会很弱很弱，可以忽略到不计，误差也会很小，光是稳定的，检测相对很稳定。

c、酶标仪设备后期维护区别

    光栅：一旦出现螺丝松动，传动误差，更换灯泡，造成中心波长偏移，那一般很难再调整回合适位置，必须由专业厂家来用专业设备调试完成，事实上国内大多数用户因为没有得到这方面的培训与告知，所以基本用了一年以后，发生了偏差也不会去找厂家去校准了。

    滤光片：结构简单，便于维护。只要稍加培训即可完成维护。

d、酶标仪仪器检测灵敏度区别

     滤光片具有非常好的透光率 (可高于85%)，也就是说光能量的损失比较少。在一个荧光检测中，经过滤光片进入样本的激发光和从样本透过滤光片进入检测器的发射光都只有少量的损失(大约10%)。光的损失较少，光的能量自然较大，荧光的信号自然很容易检测。这是获得高信噪比（SNR）的最初始保证。所以，由于有高的信噪比（SNR）保证，滤光片系统从酶标仪诞生以来一直就是高灵敏度检测的黄金标准。我们也不难发现很多有光栅型酶标仪的厂家在一些检测灵敏度要求比较高的高端应用(如：TRF、TR-FRET、等)中，都会有另外配上滤光片模块的设计。因为这些高端的应用，光栅系统未能有满意的效果或干脆做不到。

      光栅系统带来方便，但也有一些缺点。基于光路设计的问题，光栅的光能损失比滤片大很多。在荧光检测中，光源经过光栅而成的激发光已比原来的少了能量。样本被激发后会放出发射光，发射光会透过光栅去分隔出需要的波长。被分隔后的发射光能量再损失。光栅酶标仪的灵敏度没有滤光片酶标仪好的，所以在高端光栅型的酶标仪也要配备滤光片模块才能进行TRF、TR-FRET等高灵敏度需求的检测。

可分为单功能酶标仪（分为光吸收、荧光、化学发光等）和多功能酶标仪。多功能酶标仪是以上两种或更多检测模块的集成，通常情况下至少可提供光吸收、荧光这两种最常见检测功能，而一些中高端多功能酶标仪还可支持化学发光、时间分辨荧光、荧光偏振、生物发光共振能量转移，甚至还可以支持“Western Blot”和“上转换发光”等检测。

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。

检测单位用OD值表示，OD是opticaldelnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，OD=10g（1/trans），其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则，OD值与光强度成下述关系：

E=OD=logⅠ0/Ⅰ其中E表示被吸收的光密度，Ⅰ0为在检测物之前的光强度，Ⅰ为从被检测物出来的光强度。

OD值由下述公式计算：

E=OD=C×D×E

其中：C为检测物的浓度；D为检测物的厚度；E为摩尔因子。

在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。

但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。

一般酶标仪的测定波长在400～750nm或800nm之间，完全可以满足ELISA的显色测定。

目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)，其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。

当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波长处有最大吸收；

当pH值降为4.0时，最大吸收波长移至492 nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。

TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，H：O：和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。

降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min。

450nm和492nm两个波长是目前ELISA测定最常用的，考虑到双波长比色的需要，还应有630nm和405nm波长的滤光片。

酶标仪有单波长和双波长检测功能有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。

所谓的“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定；

而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。

630nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板孔上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。

通常，酶标仪的吸光度测定范围在0～2.5之间即可以满足ELISA的测定要求。早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0～2.5之间，但现在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。因此，对于酶标仪的吸光度范围不必去刻意追求大的吸光度范围，主要看在一定的吸光度范围内的线性和精密度如何

酶标仪的检测速度是指其完成比色测定所需要的时间。所谓天下武功唯快不破，检测速度快，有利于提高检测的精密度，即避免由于测定过程中，因测定时间不同所致的各微孔间吸光度间的差异。目前市场上常见的酶标仪检测速度都非常快，通常在数秒钟内。

酶标仪的震板功能是指酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行振荡混匀，使板孔内颜色均一。目前市场上常见的酶标仪均有震板功能，有所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋转等方式及振荡幅度等任意调节。使用有震板功能的酶标仪，在进行ELISA测定，显色反应完成加入终止液后，可不必振荡混匀，直接放入酶标仪测定即可。

温育功能是指酶标仪本身能按要求自动精确地控制仪器内部的温度，使得ELISA测定中微孔板条的温育过程可在仪器内部完成，而无需再外配温箱。

温育功能只是酶标仪的一个附加功能，是否具有并不能说明酶标仪档次的高低及仪器的优劣。作为实验室是否选择，则可根据自己实验室的条件及需要来决定。

软件功能是指酶标仪所具有的对ELISA定性和定量测定及其他测定方式如酶标动力学、紫外和凝集等数据的统计分析并报告结果的功能。软件功能是中高档酶标仪的一个非常重要的功能。

软件在读数前可设置读数孔、波长、计算公式等内容，在读数后显示相关数据。对于用户来说，好的软件功能，对实际工作会有较大的帮助。ELISA定性测定，酶标仪如具有阳性判断值(cut-off)及其测定“灰区”(即指测定吸光度处于cut—off周围的一定区域，此区域内结果应为“可疑”)的统计计算功能，不但方便了实验室工作人员，而且在某些特定的情况下，有很高的实用价值。

▶临床检验项目

★感染免疫室检测：乙肝五项(HBV)、甲肝抗体(HAV)、戊肝抗体(HEV)、丙肝抗体(HCV)、免疫球蛋白(IgG)、艾滋病抗体(HIV)、梅毒螺旋体抗体......

★血液免疫学检测：免疫球蛋白A/G/M/E/D、免疫球蛋白轻链κ/λ、补体C3/C4、CRP、类风湿因子、前白蛋白、铜蓝蛋白、触珠蛋白、β2微球蛋白、转铁蛋白、酸性糖蛋白、超敏CRP、血清淀粉样物质A、γ痕迹蛋白、循环免疫复合物、ANA、ENA......

★过敏原检测：血清总IgE、特异性IgE及过筛试验、ECP检查......

★肿瘤标志物的检测：癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、前列腺特异性抗原（PSA）、糖类抗原（CA199）、糖类抗原（CA125）、 糖类抗原（CA153）、鳞状细胞癌抗原（SCC）......

★生殖医学检测：弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型和II型、抗精子抗体、抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗滋养膜细胞抗体、抗hCG抗体......

▶食品安全检测项目

★过敏原：食品 ；

★三聚氰胺：农产品和食品 ；

★二噁英：农产品和食品、环境样品 ；

★兽药残留

★抗生素：农产品和食品 ；

★克伦特罗/瘦肉精：禽畜的尿、毛、肉、奶、饲料等 ；

★农药残留：农产品、食品、水、土壤等

★杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物/昆虫生长调节剂 ；

★生物毒素：食品和饲料

★黄曲霉素；贝类毒素；呕吐毒素；黄曲霉毒素B1；玉米赤霉烯酮；赭曲霉毒素A。

▶出入境检验检疫项目

出入境检验检疫项目

★卫生检疫：出入境人员丙肝、HIV、梅毒抗体检测 ；

★动物CIQ：猪传染性胃肠炎病毒（生物素标记414 nm），猪呼吸道冠状病毒（生物素标记414 nm），猪流行性腹泻，鸡传染性法氏囊病（490 nm），鸡传染性喉气管炎，牛传染性鼻气管炎（450 nm）等出入境动物病毒检测；

 ★植物CIQ：番茄黑环病毒检测、豇豆重花叶病毒（碱性磷酸酶标记405 nm）。

▶细胞增殖与细胞毒性检测

★MTT 法 ：

通过测定570nm 波长处的吸光值，可间接反映活细胞的数量。细胞增殖越多越快，则吸光值越高；细胞毒性越大，则吸光值越低。

★CCK-8：

测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

▶蛋白浓度测定（比色法）

★BCA法：562 nm；

★考马斯亮蓝法：595 nm；

★660nm蛋白分析定量试剂：660nm。

▶内毒素检测

★动态显色法（微量技术）：405nm。

▶酶活测定

原理：酶活性的检测基于底物NADH的消耗或产生，可以通过检测NADH而间接定量酶活性。

检测方法：37℃保温下，在340nm处使用动力学检测方法测定酶活性。

★具体应用：谷丙转氨酶（ALT）的检测（肝功能） 、尿素氮的检测（脲酶-NADH法）（肾功能）、葡萄糖6磷酸脱氢酶的检测（溶血病）、已糖激酶（血清葡萄糖）。