单克隆抗体制备

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。

1、获得目的抗原

1.1 原核蛋白获取

根据目的蛋白基因引物设计→扩增目的基因→构建原核表达载体→原核表达蛋白（一般用BL21）→蛋白纯化。

优点：一次可以获取大量目的蛋白；

缺点：蛋白免疫效果较差，需要多次免疫小鼠。蛋白空间构象容易改变。

1.2 病毒蛋白（衣壳蛋白、囊膜蛋白）

病毒在细胞上扩增→收集病毒液→去掉细胞杂质→浓缩病毒液→蔗糖密度梯度离心纯化病毒。

优点：免疫效果较好；

缺点：抗原不能大量获得。

2、免疫小鼠

2.1 注射部位

病毒一般为大腿肌肉注射、原核蛋白一般为皮下多点注射。

3、检测免疫小鼠血清抗体效价：酶联免疫吸附试验(以下简称ELISA)

3.1 将PK15细胞铺至96孔板，每孔1×104个细胞。

3.2 病毒感染，待细胞长至70％接种病毒液，病毒与无血清DMEM按1:200的比例混匀，每孔100 μl加入到细胞中，37℃、5%CO2条件下吸附1 h后换液，换用含1%FBS的DMEM，于37℃、5%CO2条件下继续培养约16 h。

3.3 固定细胞，病毒感染细胞约16 h以后，弃去培养基，1×PBS洗2次，每孔加入含3%H2O2的甲醇200 μl，室温固定30 min。

3.4 封闭，弃去固定液，1×PBS洗3次，每次3 min，拍干，每孔加入封闭液200 μl室温封闭1 h。

3.5 加待检血清，弃去封闭液，1×PBS洗3次，每次3 min，拍干。将血清进行2倍系列倍比稀释，每孔100 μl加入到ELISA板中，设置阴性对照（未免疫小鼠血清），室温孵育2 h后弃去。

3.6 加二抗，1×PBS洗3次，每次３ min，拍干。加入用封闭液1：2000稀释的HRB标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1 h。

3.7 TMB显色，1×PBS洗3次，每次３ min，拍干。每孔加入100 μlTMB单组份显色液，室温避光反应15 min。

3.8 终止，每孔加入100 μlELISA终止液，读取酶标仪上450nm吸光值。

4、获取小鼠脾脏

5、融合细胞

原理：PEG的水溶性强，在液相介质中，其分子表面的醚键带有微弱的负电荷，在Ca2+离子的参与下，可将带正电的表面蛋白或带负电荷的糖蛋白通过Ca2+桥相连,从而使细胞发生聚集、融合。在50%PEG中，自由水消失,可导致细胞脱水而引起质膜结构变化和细胞融合。

5.1 融合前一天将SP2/0细胞传代一次，使其处于指数生长期。

5.2 将小鼠脱颈致死，浸泡于75%乙醇中杀菌10 min。

5.3 沥干酒精后将小鼠置100 mm培养皿中，用剪刀剪开右腹部皮肤，无菌取出脾脏，置于含有DMEM的培养皿中。

5.4 将脾脏置于尼龙网上，用5 mL无菌注射器内芯研磨，并加入适量预热的DMEM，边研磨细胞，边加DMEM。将研磨的脾脏细胞悬液离心1000 rpm，5 min，弃上清。随后收集SP2/0细胞，将准备好的SP2/0细胞离心1200 rpm，5 min，弃上清。

5.5 轻弹已离心的脾脏细胞试管底部，加入吹散的SP2/0细胞悬液，将两种细胞混匀后离心1200 rpm，5 min，弃上清。

5.6 沿管壁加入1 mLPEG1450，速度控制在每分钟1 mL，边加边震荡，加完后37℃作用1 min30 s。

5.7 逐滴加入37℃预热的DMEM，前30 s加1 mL，接着30 s加3 mL，然后加11 mL补至15 mL，37℃静置5 min，期间对离心管轻缓摇动2次，之后再加25 mL37℃预热的DMEM，以彻底终止融合过程，边加边对离心管进行轻缓地晃动，然后1000 rpm离心10 min，弃上清。

5.8 轻弹离心管底部使细胞松散，加入37℃预热的含HAT的杂交瘤细胞培养基重悬，平均分到96孔板中，每孔200 μl。于37℃、5%CO2条件下培养，每天观察。

5.9 5—7天后，半量更换预热的含HAT的杂交瘤细胞培养基，并用建立好的方法检测每孔抗体分泌情况

6、阳性孔的筛选及一般实验方法

ELISA、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、免疫印迹实验（Westernblotting）、免疫荧光（IFA）。

筛选原理：

7、单克隆细胞株的获取

实验方法：有限稀释法。显微镜下观察96孔，找到由单个细胞长起来的细胞簇，检测为阳性孔得到单克隆细胞株。

8、抗体亚型鉴定

8.1 包被亚类抗体，将同种型特异性抗体每孔100 μl包被到96孔板中，4℃过夜孵育。

8.2 弃去包被液，1×PBST洗3次，拍干。

8.3 封闭，加入封闭液，每孔200 μl，室温封闭2 h。

8.4 一抗孵育，弃封闭液，1×PBST洗3次，每次3 min，拍干，加入待测抗体，每孔100 μl，室温2 h。

8.5 二抗孵育，1×PBST洗3次，每次3 min，拍干。加入1：1000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔100 μl，室温孵育2 h。

8.6 显色，弃二抗，1×PBST洗3次，每次3 min，拍干。每孔加TMB单组份显色液100 μl，室温避光15 min。

8.7 读值，每孔加终止液50 μl，酶标仪OD450nm立即读数，根据OD450nm值判定抗体亚类。

9、小鼠腹水的制备与纯化（抗体纯化）

将弗式不完全佐剂注射到12周龄BALB/c小鼠腹腔内，每只300 μl，7天后腹腔接种单克隆细胞，接种7天后采集腹水并纯化，用SDS-PAGE凝胶电泳对纯化的抗体纯度进行鉴定。

具体纯化流程如下：

9.1 取1 mL腹水和2 mL的PBS加入到烧杯中，加入3 mL饱和硫酸铵溶液，4℃搅拌2 h。

9.2 4℃、1000 rpm离心10 min，弃上清，用2 mL的PBS重悬沉淀，装入透析袋，置于PBS中，4℃、200 rpm透析12 h，然后1000 rpm、4℃离心5 min，收集上清。

9.3 装柱，将1 mLProtein G Resin加入到纯化柱中，使其中的液体自然滴落。

9.4 平衡，向纯化柱中加入PBS，至流出液OD280nm接近0。

9.5 上样，将（2）中的上清加入到纯化柱中，控制流出液体的速度为每分钟1 mL，样品反复过柱6次，用PBS洗脱杂质蛋白。

9.6 洗脱，用3 mL的甘氨酸溶液（0.01 M PH=2.4）洗脱目标抗体，收集流出液，用Tris-HCl中和PH至7-8。

9.7 将收集的抗体装入透析袋，放入PBS中，4℃、2000 rpm透析处理12 h。

9.8 纯化的抗体经SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，检测抗体纯化效果。

9.9 将剩余抗体，做好标记-80℃储存备用。