金标试剂假阳和假阴的原因分析

1、假阳：

大多数假阳性信号出现的原因都是由于相似的问题，即在常规的结合步骤进行时蛋白与胶体金颗粒特异性结合。在此过程进行期间，蛋白质被三种主要的力吸收在胶体金的表面上。

（1）电荷引力：胶体金颗粒带有负电荷，这是由于在将氯金化钠转化为胶体金时，使用的还原剂（经常是柠檬酸盐）带有的一层负电荷被吸附在胶体金颗粒的表面。负电荷将吸引带有正电荷的蛋白并且足以使其靠近结合区的表面，这样就有可能发生假阳性。低于等电点的蛋白带有正电荷，因此可能会与胶体金颗粒表面发生强烈的吸引作用。尤其是带有富含赖氨酸和精氨酸的蛋白区域在低于赖氨酸的等电点（pH 10.4）和精氨酸的等电点（pH 12.5）时会带有大量的正电荷。

（2）疏水作用力：一旦蛋白质彼此十分接近（之间的距离大约小于1nm），蛋白质的任何疏水区很有可能与胶体金表面的疏水区接触并且与之结合。因此富含非极性氨基酸（例如色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸）的蛋白质会与胶体金表面发生强结合作用。

（3）配位键结合力：配位键结合力是所有吸引力中最强的结合力。含有大量富含硫的氨基酸（由于存在半胱氨酸和甲硫氨酸）的蛋白质强结合胶体金颗粒表面。这是由于在金原子（具有传导带电子的能力）和硫原子（带有价电子）之间的吸引力造成的。

（4）伴随捕捉抗体而产生的假阳性信号：有许多因素可能会影响捕捉抗体发生非特异性结合反应。产生假阳性信号可以归结于疏水作用力、非特异性免疫反应、抗体中的添加物、带有大量的正电荷、在与胶体金颗粒吸附的捕捉抗体中富有高浓度的含硫氨基酸。在标记过程中这些因素都会引起抗体与胶体金颗粒表面吸附并与其结合。有些样品可能非常具有粘性的（例如血清），这种因素也会使流速减慢。当检测体系中没有足够的样品或活性物质来使金标沿着检测带移动时，胶体金颗粒也会粘附在捕捉抗体带上。

（5）样品的问题：许多样品中含有可能与金标粒子或捕捉抗体发生非特异性结合的物质，并且产生非特异性结果。举例来说，一些含有细菌的样品，而样品中的细菌可能被部分破坏成细胞碎片，并且这些细菌是非常疏水的。这些疏水的细菌碎片也可能与捕捉抗体和金标粒子发生交叉反应。其它的一些样品可能含有高水平的硫或SH 基团，或者具有高正电荷。此外，一些样品可能含有大量的分子或细胞分子，这有可能阻塞膜并且对检测带上的金标液的流动产生干扰。样品可能在酸性条件下变化非常大。例如，尿液样品最初的pH 值是在4~7之间，然而随着细菌含量的增加，样品的pH 值也随之降低。酸性样品在流动过程中在捕捉抗体表面产生正电荷，反过来这将引起与带有负电荷的金标粒子发生非特异性反应。如果样品含有大量的酸性物质或者带有大量的正电荷蛋白质，它们在到达捕捉抗体区之前可能与金标粒子非特异性结合。这不仅能掩盖待测物与金标的结合信号（因此产生降低特异性信号效果），也能增加与在膜上和捕捉抗体带上成簇物质的结合物。

2、假阴：

假阴性产生的原因大多是捕捉抗体和金标液，但是也可能是由于检测体系中膜的流动性不好（流速太快或太慢）、金颗粒的释放不充分、盐量不足引起的，或者是由于体系中酸度不适宜造成的。另外，需要对样品进行处理才能让抗体与抗原结合，或者需要对样品进行稀释以避免hook效应，或者通过改变样品成分掩盖一些特殊的抗原。捕捉抗体在储存的过程中时常变得不稳定并且会失去特异性活性，可能是由于水解作用（潮湿环境和干燥不充分），也可能是由于的疏水作用力的破坏。后者可能是抗体自身的特性，通过更换抗体或撕掉捕捉抗体层后用活性剂处理膜可以解决这个问题。抗体或金标液潜在的不稳定性要说明了检测应当在可控的干燥环境的条件下进行。

假阴性结果的产生常常是由样品与金标的原因，或者是膜带的流动性的原因。很多的因素能够导致类似的现象。这其中包括样品的量不足、金标液或样品垫上糖量不足、标记垫和膜的结合不紧密或者是标记垫的材料不适合。这些样品可以通过用没有C 带（总是阳性）的检测条证明。如果金标暴露于潮湿的环境，其中的糖很可能结晶，这可能会导致金颗粒不能在膜上移动。