找回密码
 立即注册

QQ登录

只需一步,快速开始

  • QQ空间
  • 回复
  • 收藏

【冯仁丰】C-反应蛋白的参考物质—ERM-DA472和ERM-DA474 1

归去来兮 2023-9-20 01:45 PM 345人围观 技术

C反应蛋白的参考物质

ERM-DA472和ERM-DA474

一、建立ERM-DA470(CRM-470)参考物质

1993年,欧洲共同体参考局(European Community Bureau of Reference ,BCR)发布的参考物质CRM-470,是临床实验室检测各种血清(或血浆)蛋白(曾被称为特种蛋白)国际认可的参考物质。由于从设计、制备、和定值各个环节,都给与充分的研究和保证,这个参考物质从发布起,立即得到了全世界临床实验室的广泛认可。从此,全世界的体外诊断厂商的各种蛋白的检测系统,凡是在CRM-470参考物质中被确认的,均以CRM-470为准,校准它们的校准品定值。使全世界临床实验室对病人血清(或血浆)的这些蛋白检测结果,逐渐实现了良好的可比性。基本上满足了临床对病人疾病诊断和监视的要求。


二、2008年出现了ERM-DA470k/IFCC和ERM-DA472/IFCC

从2008年起,欧共体参考局将发布的参考物质重新命名为ERM(European Reference Material),强调是欧洲的参考物质。因此,原CRM470的参考物质,被更名为ERM470。并且完全按照参考局对所有参考物质分类编排,临床实验室专用的参考物质为DA类;而且非常强调,这个参考物质一直是在国际临床化学协会(IFCC)支持和配合下完成的,因此更改后的这个CRM 470的全称改为ERM-DA470/IFCC。


2008年,该参考物质即将用完,因此需要再制备一批。承担研究制备这个参考物质的是比利时海尔市(Geel)欧共体联合研究中心,参考物质和测量研究院(IRMM)。该中心的I.Zegers负责这项任务。工作组完全按照原ERM-DA470的制备方案,制备新一批的参考物质。制备完成的制品依然被称为ERM-DA470。


该参考物质也完全按照原先方案,将血清分装后进行冷冻干燥处理。


经检测发现,新一批的ERM-DA470内C-反应蛋白的实际含量,只是分装前液体物质内具有的CRP的约80%。出现了明显减少的偏移。


为此,经研究决定,将冷冻干燥的这个参考物质命名为ERM-DA470k/IFCC。对其中12个蛋白进行了定值。取代ERM-DA470。C-反应蛋白没有包括在这个参考物质内。


为了提供一个对CRP以后使用具有最佳条件的参考物质,将制备ERM-DA470k/IFCC的原液体物质(冷冻干燥前的液体血清),分装安瓿后封口后置深低温冰冻保存于-70℃,成为专门为CRP检测使用的参考物质,命名为ERM-DA472/IFCC。


ERM-DA472/IFCC使用了ERM-DA470参考物质为校准物为CRP定值。使用了目前认为是参考程序的值转移方案予以实现。用于测量(检测)CRP浓度的原理为免疫散射和免疫透射。在不同的仪器/试剂组合下(Abbott Architect、Beckman Immage、BN Ⅱ、不同的Hitachi仪器、和Olympus AU 640)进行测量。有8个实验室参加了定值。被确认的CRP质量浓度为41.8 mg/L,扩展的不确定度(k=2)为2.5 mg/L。


三、冷冻干燥造成CRP回收问题的表现和原因

造成ERM-DA470k/IFCC经冷冻干燥后,内含的CRP检测结果回收不佳(见图1)。

图1、IRMM检测经冷冻干燥和液体血清内CRP的回收表现。

经研究确定是CRP在冷冻干燥过程中,是内含CRP产生了解离。原先具有生物活性的人CRP,在血浆中呈一个五聚体结构。(图2)

图2、在人血浆中天然CRP为五聚体蛋白。由五个相同的单体组合。每个单体的分子量约为25105 Da。五聚体内结合了2个Ca++

1、CRP的不同低聚物形式对检测结果的影响:

临床检验的免疫检测,检测的是目标蛋白与对应抗体间形成的凝聚物(是凝聚物使分析仪上入射光的散射或透射光强度变化,产生了检测信号的变化)。

该图以三聚体代表CRP的五聚体形式。蛋白与检测抗体相遇结合,开始形成增大的聚合物。

在反应物中,抗原抗体凝聚物继续发展,产生更大的凝聚物成为可检测信号。样品内的分析物含量被检测了。

但是,经诸如冷冻干燥处理中,使原先的蛋白分子被解离,加入的抗体与解离的抗原分子难以形成聚合物,产生不了可检测信号!


因此,从校准开始因低聚物状态而变化,严重影响了检测过程!最后变得无法检测。


上述解释也许是当前对采用抗原抗体反应,经冷冻干燥处理后产生严重后果的较好解释。


2、为什么ERM-DA470/IFCC没有报告冷冻干燥对CRP检测结果的影响?

很长时间里我也有想法,为什么第一批ERM-DA470/IFCC,也经历了冷冻干燥处理。应该也发生了上述的变化。但为什么没有报告反映,冷冻干燥对检测结果的影响进行分析研究?当时的CRM470研究中,应该也检测了回收率,怎么没有出现如ERM-DA470k/IFCC内,如此不佳的回收表现?


我再次查阅原CRM-470的资料,认真查对。发现当时在制备CRM-470 时,没有对用于制备参考物质的原始混合血清内含有的CRP,进行过检测!将外加的CRP混到血清中,也没有检测冷冻干燥前CRP的含量!只关注了冷冻干燥后经复溶液内被所有参与定值实验室,检测结果的一致性!这个漏洞大家都被疏忽了!


感谢IRMM参与制备ERM-DA470/IFCC的团队!他们确实非常认真地检查了整个制备全过程的内容!


如果,2008年的整个制备过程记录,也像1993年那样,忽略记录参考物质内含有的CRP含量的变化,那么也不会出现今天的ERM-DA470k/IFCC和ERM-DA472/IFCC两个参考物质了!感谢IRMM的团队!

未完待续

TO BE CONTINUED


转载请注明出处

微信公众号:冯仁丰

来源: 冯仁丰
我有话说......