荧光定量PCR实验Ct值分析

qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。

模板量与Ct值的关系：

在PCR指数扩增过程当中，产物量与循环数之间的关系是：扩增产物量=起始模板量×（1+En）循环个数。

Ct值的设定：

qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在扩增过程当中，设定一个荧光信号值，当扩增产物量达到“一定产物量”时（即达到此荧光阈值时），此时循环数定义为Ct值，需要注意的是，Ct值需要处于指数扩增时期。因此Ct值与起始模板量的关系：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。

Ct值的重现性

Ct值是荧光定量PCR最重要的结果呈现形式，用于基因表达量差异或基因拷贝数的结果计算。一般情况下，复孔Ct值的差值最好不超过0.05，不然表明误差结果太大，结果不可信。在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显的区别；之后荧光的产生增加进入指数期，此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

扩增效率En

PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1个DNA分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。En是一个非常重要的参数，Ct值可不可信，需要评估En是否正常，En的正常范围为90%-110%之间，影响En的因素有很多，常见的因素如下表：

Ct值的范围

Ct值的范围为15-35。但是一般建议对于不同的基因Ct范围，因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围以及En。

Ct值异常的原因与解决方案