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RT-qPCR——欠缺重复性的分析

归去来兮 2021-12-27 115人围观 技术


Real-Time qPCR(RT-qPCR)优点众多,目前已成为生命科学领域的一项常规技术,越来越多的研究文章中涉及到RT-PCR实验,也基本上被Real-Time qPCR所替代。近十几年来,RT-qPCR的论文大量发表,仍面临着专业规范的问题。

主要表现在以下两个方面>>


01  70%-80%提供数据仍不采用PCR实验指南(MIQE)数据规范及实时定量PCR数据的结构化语言和报告指南(RDML)语言规范,表达不规范、说服力不足、结果表述不清、数据无法重复等问题导致被撤稿。


0 追求试剂“低价”或“品牌崇拜”,缺乏科学的试剂质量评价 方法,方法体系的不严谨将造成错误的结论。

以“”real time PCR”为关键词在 Pubmed 检索到的年度论文数



2017年Stephen Bustin等调查显示——说一套,做一套,RT-qPCR是分子生物研究中缺乏重复性的典范。(Talking the talk, but not walking the walk:RT-qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecularresearch)作者指出许多分子生物学研究缺乏重现性的根本原因是分子测量方法报告不充分。RT-qPCR是RNA定量最直接的测量技术之一,广泛应用于研究、诊断、法医和生物技术应用,尽管定量PCR实验指南(MIQE)旨在提高RT-qPCR数据报告的规范性和透明度,但调查显示错误的试验方法、不适当的数据分析和不充分的报告仍然普遍存在,大多数已发表的RT-qPCR数据可能造成实验结论误导。



01

结果再现性问题

2013年,《自然》(Nature)杂志发表的一篇论文综述得出结论,自MIQE指南发布以来,有关RT-qPCR方案的必要信息的报告实际上有所恶化。虽然指南强烈建议纳入必要的技术信息,但分析的10篇论文中没有一篇报道了这一信息。这意味着没有向读者提供任何有关RNA完整性、RNA纯度、RT条件或PCR效率的信息,而且所有的出版物都使用了一种不恰当的数据分析方法,这种方法在15年前已经被质疑。作者对《自然》杂志的20篇近期论文进行了重复分析,得出了基本相同的结论。更讽刺的是,报道透明度与期刊的影响因子呈负相关。


20个出版物提供的关于RT-qPCR的技术信息摘要







02

研究RNA表达的方法


RNA图谱分析依赖于多种方法,有些方法相对简单,有些方法则复杂得多,有些方法限制于低通量,还有一些方法允许并行处理大量样本。作者对目前使用的主要RNA分析方法进行了简要概述,阐述了许多使用基于RNA的方法发布的数据的可靠性和生物/临床相关性引发激烈辩论的问题,并阐明了导致这些结果不可靠且需要修正的各种原因




01
PCR是目前大多数使用的方法,而使用凝胶电泳进行PCR分析仍在继续使用。对PCR相关衍生的问题的认识由来已久,早在1992年就有第一份报告描述了实验室内和实验室之间对复制和连续标本进行评估的不一致性。缺乏一个涉及PCR的动态过程的理论理解,特别是关于不可复制或意想不到的扩增产物的扩增,在几十年前也被强调。这些观察结果和由此产生的影响在很大程度上被忽略了。

02

qPCR和RT-qPCR是快速、简单定量核酸的方法,并继续被广泛使用,2016年PubMed搜索逆转录实时PCR或RT-qPCR或qRT-PCR,有近5400个引用。但是该方法的再现行。可靠性和一致性收到质疑,


03

微阵列技术与RT-qPCR相比可以处理更多的样本,比但由于执行和分析数据所需的复杂性和时间的增加,这种方法的流行度正在下降,2016年PubMed搜索“微阵列”一词大约有1600个引用。


04

RNA-seq是所有RNA profiling方法中技术最复杂、最昂贵、最耗时的一种,使得复制或重复实验的可行性较低。


05

另外两种中等通量的RNA分析方法是NanoString公司的nCounter分析系统和Thermo Fisher公司的OpenArray系统。前者的优点是不需要RT步骤,后者减少了所需的样品处理量。比较两种技术和RT- qPCR的mRNA丰度分析发现,三种方法的结果具有广泛的可比性。然而,尽管NanoString和OpenArray的结果有很好的相关性,但RT- qPCR数据与两者有显著差异。作者将其归因于常规RT-qPCR需要大量的移液操作,从而增加了样品制备的可变性。这些结果也表明,即使以适当的方式进行了技术和分析,结果也可能是不一致的。这也存在一种可能,即RT-qPCR结果是正确的,而其他两种方法得到的结果是错误的。




03

RT-qPCR存在的问题


RT- qPCR工作流程表面上简单的结果是,一方面,许多未经培训和不熟练的操作人员采用了这项技术。另一方面,不知道从哪里查找并识别问题所在,确定报告的结果是否可能是真实的。下面概述了妨碍对结果进行一致解释的方法问题,并举例说明了为什么报告的结果常常如此不可靠。


01
RNA的质量

相关的质量控制措施是任何分子生物学实验前的必要准备工作,包括确保可靠的qPCR检测。RNA在提取和保存过程中有各种物理和化学因素的降解核酸,因此纯度和完整性是非常重要的。RIN值大于5的总RNA可以划分为优质RNA,大于8的RNA可以划分为完美RNA。这并不是一个理想的分类,因为降解与抑制类似,它不是一个恒定或稳定的过程,而是以不同的方式影响转录。这种不一致的一个严重后果是,对纯度或降解程度不同的样品进行比较,可能会显示出差异,实际上并没有差异,或者掩盖了任何实际差异。这种不一致性直接影响基因表达结果,从而会影响实验结论。



02
逆转录步骤

在首次PCR实验报道后不久,结合RT和PCR步骤检测RNA靶点的潜力就被发现了,并在随后不久被建议将其用作定量分析。随后发现,定量RNA并不像定量DNA那样简单,比如RNA逆转录后通过PCR进行扩增取决于RNA浓度和引物设计以及在引物结合位点避免大量的二级结构,不同的RT酶受到这些二级结构的不同影响。逆转录步骤实际上是可变的,因为它是由不同的实验人员进行的,实验人员使用了不同数量的RNA、各种cDNA反转录的方法和不同的逆转录酶。这导致了不同实验室报告的RT-qPCR结果可能不一致,而且很难确定哪些结果是真实的,哪些结果是错误的,尤其是在没有足够的分析设计参数和实验方案信息的情况下。



03
PCR步骤

聚合酶链反应的稳定性并不像看上去那么好,这有几个原因:

a.许多已发表的PCR分析要么设计不充分,不可能只扩增预期的目标,要么发表的信息不正确,导致发表错误的引物或探针序列;


b.最佳的PCR性能在很大程度上取决于适当的模板制备方法;


c.认为qPCR检测分辨率足够高的假设是错误的。


d.不同制造商的“定量PCR预混液”是不同的,不同预混液可能会影响最后的“差异倍数”值;


e.对于一些目的基因,选择一步法RT-qPCR和两步法RT-qPCR也会造成结果的不一致;


f.许多商业化热启动Taq在热启动前似乎没有经制造商的封闭性测试,容易产生非特异性扩增,形成引物二聚体


g.目的基因和内参基因的扩增效率不在线性范围内,而且二者的扩增效率也不一致,这极大影响了实验结果的真实性。





04

规范操作建议

01
引物和探针的验证

由于任何PCR检测的特异性和效率都严重依赖于引物和探针,如果使用,这些都需要仔细检查。实际应用中有频繁的错误,包括简单的排版错误,对寡核苷酸序列取向混乱,缺乏特异性的引物,设计跨内含子的PCR扩增子。


02
测定核酸的质量和完整性

核酸的质量和完整性对于定量结果的影响是很大的,报告中为提供此项内容,意味着永远不清楚作者是否真的检查了抑制剂的存在,并确定了RNA样本的完整性,或者只是不报告他们的结果。


03
RT步骤做3个重复

RT步骤应该以3个重复的方式进行,而对于每个RT反应只进行一个qPCR就足够了。


04
PCR的扩增效率应该一致

扩增效率的不一致,在使用2-△△cq进行基因表达分析时,得到的fold changes值是不准确的,不是真实变化值,这可能会极大地提高基因表达分析的准确性。


05
选择稳定表达的内参

使用多个、稳定且经过验证的内参基因对RT-qPCR数据归一化至关重要,因为它消除了固有技术或实验诱导的差异。


06
提供原始数据

Cq数据应该作为补充信息提交,可以以电子表格的形式提交,也可以直接以RDML格式导出。




 

本文编辑:乐乐高


来自: toroivd
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