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关于CRISPR的技术与八卦

归去来兮 2020-11-6 47人围观 杂谈

本帖为CRISPR扫盲贴,上半部聊技术下半部聊八卦。


一、CRISPR检测技术篇


1.什么是CRISPR


Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats,简称CRISPR。

CRISPR-Cas系统是微生物体内的一种RNA指导的适应性免疫系统。它利用RNA来引导核酸酶与特定核酸序列相结合并且将它们切断。当病毒入侵细菌时,细菌能够捕捉到外来遗传物质的片段并且将它们整合到自身基因组中的CRISPR序列中。CRISPR序列转录生成的CRISPR RNA(crRNA)能够与Cas核酸酶相结合,通过与靶点核酸序列进行碱基配对为Cas核酸酶提供结合特异性。Cas核酸酶和crRNA结合之后,能够在细菌体内起到监控病毒入侵的作用,当与crRNA匹配的遗传片段再度出现时,Cas核酸酶能够切断这些遗传片段,从而提供免疫保护作用。

CRISPR系统的工作原理(Eric S. Lander, (2016), The Heroes of CRISPR, Cell

    

在众多天然CRISPR-Cas系统中,2类(class 2)系统只需要一个RNA指导的Cas核酸酶就能够完成对靶点的切割。其中Cas9核酸酶成为了第一个被用于基因组编辑的Cas效应子。CRISPR-Cas12a能够靶向切割DNA序列,Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶,专一的切割RNA,不切割DNA。这些由RNA指导的核酸酶系统的可编程(programmability)特点是CRISPR-Cas系统能够在精准基因组编辑以外获得广泛应用的关键。


2类CRISPR-Cas系统(图片来源:《科学》)



2.SHERLOCK


在Cas13a和Cas12a中RNA指导的核酸酶活性促进了创新核酸检测工具的研发。对于Cas13和Cas12a来说,靶点核酸通过与指导RNA的碱基配对,会激活普通的核酸酶活性。利用这种可控的核酸酶活性,Cas13被用于从大量RNA中检测特定RNA序列的存在。
2017年4月,CRISPR基因编辑大牛张锋,在 Science 杂志发表论文,发明了基于CRISPR/Cas13的病毒检测技术。张锋将这种检测技术命名为——SHERLOCK(Specific HighSensitivity Enzymatic ReporterUnLOCKing),这一与神探夏洛克·福尔摩斯同名的检测技术,可以让被切割的RNA形成条带,形成视觉可见的线索,并直观展示出来。

目前已有用于登革热病毒、寨卡病毒和与癌症相关的人乳头瘤病毒(HPV)毒株的CRISPR检测诊断。



3.CRISPR与新冠检测

 第一版CRISPR检测方法
2020年2月,张锋教授团队利用基于CRISPR的技术,开发了一种检测新冠病毒RNA的方法。它仅需纯化的核酸分子样本,通过简单的三步,就能在1个小时的时间里完成检测。

从原理上看,这项技术并不难理解。SHERLOCK的核心是一种叫做Cas13a的酶和与其结合的向导RNA。根据新冠病毒的RNA序列,研究人员们精心设计了两种向导RNA,一种识别新冠病毒的S基因,另一种识别Orf1ab基因。为了最大程度提高检测的准确率,科学家们挑选的都是最具新冠病毒特异性的序列。这样一来,其他呼吸道病毒基因组带来的干扰也能被降到最低。

基于这个设计,理论上说,只要样本里有新冠病毒所对应的RNA,向导RNA就能对其进行精准的识别,并激活与其结合的Cas13a蛋白。Cas13a是一种很有趣的酶,一旦被激活,它就会切开它所遇到的任何其他RNA分子。也正是利用这种特性,研究人员们在样本里还会添加一种通过RNA相连接的特殊分子。一旦Cas13a得到激活,这种特殊分子上的RNA就会被切断。这样一来,通过确认这些分子有没有被切断,我们就能知道最初的样本里有没有新冠病毒的存在。
后续的检测工作并不需要太多繁琐的步骤,所需的仅仅是一些能够特异识别“完整分子”和“切断分子”的试纸。如果样本里不存在新冠病毒,那么试纸标识“完整分子”的较低位置上,就会出现一条条带;相反,如果样本里真的有新冠病毒对应的RNA,那么在代表“切断分子”的较高位置上,会出现另一条条带。通过条带位置的不同,我们很容易就能确认新冠病毒的存在与否。
研究人员们表示,在测试中,他们能够稳定检测出新冠病毒的序列,而且灵敏度很高——每微升里仅需100个拷贝,乃至10个拷贝,都可以被检测出来。

CRISPR Covid检测的测试流程(图片来源:参考资料[1])

操作步骤

  • 利用常规的同温扩增技术,对提取的核酸样本进行扩增。这一步需要25分钟,维持42摄氏度。

  • 在样本里加入Cas13蛋白,向导RNA,以及起到报告作用的特殊分子。然后在37摄氏度下,继续反应30分钟

  • 使用试纸对第二步里获得的样本进行检测。这一步大约需要2分钟的反应。


 第二版CRISPR检测方法STOPCovid

2020年5月,张锋教授和他在Broad研究所,公布了他们开发的新一代新冠病毒CRISPR检测技术的实验流程。这款最新的检测手段比2月份的检测技术更进一步,检测过程中不需要从患者样本中纯化RNA,并且将检测新冠病毒所需的化学反应步骤在一个试管中完成。研发团队将它命名为STOP(SHERLOCK Testing in One Pot)。


为了让等温扩增步骤和Cas酶检测的化学反应能够在同一个试管中进行。他们选择了环介导等温扩增技术(LAMP)作为扩增RNA的方法。然而LAMP反应需要在温度为60℃的反应条件下进行,而Cas13a在这一温度下不够稳定。研究人员找到了名为AapCas12b的Cas酶,能够在LAMP反应条件下维持足够的活性,同时对指导RNA和反应中的添加剂进行了优化,让Cas酶介导的检测步骤维持足够的灵敏度。在实验条件下,这一检测的下限为100个新冠病毒RNA分子

研究人员同时简化了提取RNA的步骤,只需要在含有新冠病毒的咽拭子或唾液样本中加入裂解病毒,释放RNA的试剂,无需纯化分离RNA,就可以将释放的病毒RNA用于检测。

STOPCovid检测的测试流程(图片来源:参考资料[2])


 第三版CRISPR检测方法STOPCovid.V2

2020年9月,张锋教授和他在Broad研究所公布了他们进一步改良的基于CRISPR技术的新冠病毒简易检测流程。这一流程被称为STOPCovid.V22.0版的STOPCovid在原有检测的基础上更进一步,在样本制备的过程中通过加入磁珠富集样本中的RNA,从而通过提高PCR反应的起始RNA数量,进一步提高了STOPCovid.V2的检测灵敏度。

在最初的STOPCovid检测流程中,张锋团队将扩增RNA数目的等温PCR步骤和使用Cas酶检测新冠病毒特定序列的化学反应合并在同一个试管中进行。这一检测步骤不需要复杂仪器,只需要在60摄氏度的恒温反应,就可以通过侧流试纸读出检测结果。然而,在进一步检测中,研究人员发现,这一简易版流程只能发现60.5%传统RT-PCR检测出的阳性患者。

为了提高检测的灵敏度,STOPCovid.v2的流程中加入了通过磁珠富集鼻咽拭子中新冠病毒RNA的步骤,使用普通实验室中用于富集RNA的磁珠,研究人员可以收集鼻咽拭子中包含的所有病毒RNA作为反应的起始材料,而且研究人员同时精简了磁珠富集RNA的操作步骤,去除了乙醇清洗和洗脱过程,让整个RNA富集过程不超过15分钟。


STOPCovid.V2的操作流程(图片来源:参考资料[3])

在华盛顿大学进行的一项设盲检测中,研究人员检测了STOPCovid.V2检验202个新冠病毒阳性和200个新冠病毒阴性鼻咽拭子样本的结果。研究人员发现,STOPCovid.V2能够达到93.1%的灵敏度和98.5%的特异性。阳性样本只需15-45分钟就能获得结果。


二、CRISPR八卦篇

1.CRISPR与诺贝尔奖

    2020年10月7日,诺贝尔基金会宣布,近年来火热的CRISPR基因编辑系统斩获本年度的诺贝尔化学奖,在这一领域做出卓越贡献的Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授摘得桂冠。正如人们所说的那样,这一革命性的发现为整个生物技术领域提供了无限可能。

    CRISPR技术获得诺贝尔奖是实至名归,但是让人遗憾的一个是居然是化学奖,另一个是张峰痛失大奖。

2.CRISPR三巨头

2012年8月17日,詹妮弗·杜德娜(Jennifer Doudna)和埃玛纽埃尔·卡彭蒂耶(Emmanulle Charpentier)合作,在 Science 杂志发表了基因编辑史上的里程碑论文,成功解析了CRISPR/Cas9基因编辑的工作原理。

2013年2月15日,张锋在 Science 杂志发表了,首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于哺乳动物和人类细胞。

自此,近年来生命科学领域最耀眼的技术正式宣告诞生,杜德娜卡彭蒂耶张锋三人,也被人们称为CRISPR三巨头

由于CRISPR基因编辑技术在疾病治疗、疾病检测、遗传育种等领域有着巨大优势和前景,三巨头分别成立公司,开始CRISPR基因编辑的商业化应用。
张锋率先创建了Editas Medicine公司,詹妮弗·杜德娜(Jennifer Doudna)创建了Intellia Therapeutics公司,埃玛纽埃尔·卡彭蒂耶(Emmanulle Charpentier)创立了CRISPR Therapeutics公司,这三家公司均已上市。

3.神仙打架

    卡彭蒂耶杜德娜的论文发表后半年,张锋Science杂志发表论文,将CRISPR/Cas9基因编辑成功应用到了哺乳动物和人类细胞,张锋成了第一个用CRISPR/Cas9编辑哺乳动物细胞基因组的科学家。如果说卡彭蒂耶杜德娜发现了一座金矿,那么张锋就相当于是最先找到了这个金矿中的金子。如果按照学术界谁先发现就归谁的惯例,CRISPR/Cas9的发现,就成了一笔糊涂账。

    一开始,张锋连同杜德娜等人合伙创建基因编辑公司——Editas Medicine,没过多久,杜德娜等人就和张锋等谈判破裂,杜德娜单飞出去办了一家名为Intellia Therapeutics的公司。两个阵营关于CRISPR/Cas9的专利之争,摆上了台面。

    按理说,杜德娜和卡彭蒂耶发表论文在先,申请专利也比张锋他们早得多,优势很大。但这愣是被张锋团队一套组合拳给破功了。首先,张锋团队借助一系列司法解释把CRISPR的专利拆成了好几十份,从法理上把“金子”和“金矿”的所有权分了开来,然后又花钱走了专利审核的“快速通道”,让他们的专利比杜德娜的更早获得通过。 最后,他们还巧妙运用了美国时任总统奥巴马的一些新政策,提出这个专利的有效性要基于“谁先完成研究”而非“谁先申请专利”,为此张锋瞬间掏出了过去两年的详细实验记录,明明白白地记录着他早在杜德娜的论文发表之前就已经走在了她的研究进度之前。
    此外,张锋果断宣布对学术界开放CRISPR/Cas9基因编辑的专利,只要研究不是出于商业目的,就可以随意免费地使用。不仅如此,他还把自己的研究资源放到公共库Addgene中,免费分发于天下,一举赢得了整个学术界的支持。更重要的是,张锋团队很快就把CRISPR/Cas9玩出了花——自2013年至今,张锋发的论文之多足可用排山倒海来形容,随便哪一篇开拓这一片科研新天地。自CRISPR/Cas9发明以来,其一半重大突破都出自张锋之手,剩下的也多少用到了张锋免费分发的科研资源,几年下来,张锋在基因编辑领域一哥的地位几近无可撼动。
    2014年,美国专利商标局USPTO)批准了张锋所在的研究所的专利请求,来自加州大学的上诉也在2016年被悉数驳回。
    在专利上吃亏的卡彭蒂耶和杜德娜,在高级学术奖励上频频收获,2015年她俩就获得了有豪华版诺奖之称的“生命科学突破奖”,2016年,两人再获阿尔珀特奖,2020年,两人又同获沃尔夫奖。如今两人又同获诺贝尔奖,真是失之东隅、收之桑榆。
申明:文章引自网络,如涉及侵权,请联系作者进行删除。
参考资料:

[1] A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, Retrieved February 14, 2020, from https://static1.squarespace.com/static/5b7c640be2ccd1703a3da4d3/t/5e46d16cf617da2f796f926e/1581699437272/COVID-19+detection+%28v20200214%29.pdf

[2]Point-of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics.   Retrieved May 5, 2020, from https://www.stopcovid.science/docs/STOPCovid%20Whitepaper.pdf

[3] Joung et al, (2020). Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing. NEJM, DOI: 10.1056/NEJMc2026172

[4] Knott and Doudna. (2018). CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science, https://doi.org/10.1126/science.aat5011

来自: 原博士带你做检测 | 作者:原博士
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