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自动化临床微生物检测系统与质谱鉴定结果的差异及鉴别

归去来兮 2020-11-4 48人围观 技术


作者:马爽1  汤凤珍2  杜利军2  伍国达3  冯峰2  程璐2  马翔4
单位:1.广州市花都区妇幼保健院检验科;2.广州市花都区人民医院检验科;3.广东省江门市中心医院检验科;4.广州市花都区人爱医院检验科


随着科技的进步,自动化微生物鉴定系统、MALDI-TOF MS基质辅助激光解析电离飞行质谱仪鉴定在临床微生物室的广泛应用,极大的提高了对临床微生物的鉴定能力。由于微生物的种、属繁多,存在多样性、复杂性,选择的鉴定特征可能难以代表全部被鉴定菌株,特别是少见菌、疑难菌、分类“未明确菌”。当“试验组合”不是所鉴定菌属、菌种“独有的”特征时,会出现不明确、不能鉴定、近缘菌株不能区分的结果,微生物自动化鉴定系统根据鉴定卡/盘中“固定的”生理生化特征鉴定,不能追加鉴别试验,也容易出现问题。此外,显色培养基虽具有快速筛查目标菌的优势,但对于类似色素的菌株还需要进一步鉴别。志贺菌属、沙门菌属、大肠埃希菌O157、霍乱弧菌等不能仅凭生化特征鉴定,还需要血清学的确认。不同的菌属在培养条件、菌落形态、色素、气味以及染色性质、菌体形态、动力等不尽相同,甚至有“独特性”。细菌的革兰染色是自动化微生物仪鉴定的重要方向性试验,如果革兰阴性菌错用革兰阳性菌鉴定卡可能有鉴定结果,但得到的结果南辕北辙,反之亦然。

本文基于大量常规鉴定经验,总结在使用自动化系统过程中,通过不同鉴定方法的互补,重视表型特征的观察,提高临床微生物鉴定的质量和水平,为临床提供准确的病原学结果。


一、全自动微生物鉴定仪的结果差异及鉴别


任何微生物鉴定系统都有可鉴定菌种的范围,实验室人员要了解应用系统的鉴定菌谱。


通常全自动微生物鉴定系统能够对大多数临床常见菌株鉴定到种,但对少部分菌株只能鉴定到复合种、群,实验室针对这种情况需要补充鉴别试验才能鉴定到种水平,这关系到药敏试验的敏感性结果解释。VITEK 2操作手册[1]指出了一些菌属、菌群的菌株需要进一步鉴别,以下举例说明。


1. 奥斯陆莫拉菌生理生化鉴定:该菌在营养琼脂及麦康凯平板上不生长,在血平板上生长缓慢,35℃孵育48h菌落细小,湿润,凸起或者扁平,不溶血。为革兰阴性球杆菌,散在或者成对排列,无动力。氧化酶阳性,过氧化氢酶阳性,葡萄糖O/F:不利用。


奥斯陆莫拉菌使用VITEK 2 Compact的GN卡鉴定为莫拉菌群(99%概率,极好的鉴定),用NH卡鉴定为卡他莫拉菌(91%概率,好的鉴定)。莫拉菌属部分菌种生化鉴别特征见表1,鉴别反应及结果图示见图1。



【鉴别要点】(1)使用GN卡鉴定为莫拉菌群,当临床需要时要进一步鉴定到种,鉴别特征见表1。(2)使用NH卡鉴定为卡他莫拉菌,鉴定概率91%,为好的鉴定。此卡以鉴定奈瑟菌属和嗜血杆菌属为主,不能鉴定莫拉菌属,卡他莫拉菌现称作卡他布兰汉菌。根据细菌的菌落形态、菌体特征,这个菌与卡他莫拉菌差别较大,并且,脱氧核糖核酸酶(DNA酶)阴性,可以排除卡他莫拉菌。因此,即使NH卡鉴定率高,也是个错误的鉴定。(3)根据丁酸酯酶阳性、DNA酶阴性可鉴定为奥斯陆莫拉菌。


2. 嗜水气单胞菌鉴定:气单胞菌属细菌在血平板上β-溶血或不溶血。为革兰阴性杆菌,有动力,发酵葡萄糖产酸或产酸产气,氧化酶阳性。本实验室对10株嗜水气单胞菌用VITEK 2 compact鉴定,报告为嗜水/豚鼠气单胞菌(极好的鉴定,98%),需进一步做鉴别试验确认鉴定结果,鉴别试验见表2,鉴别反应及结果图示见图2。



3. 铅黄肠球菌鉴定(ATCC 700327):在血平板上35℃孵育48~72h的菌落黄色,α-溶血,为革兰阳性球菌,过氧化氢酶阴性。肉汤培养物链状排列典型,有动力。此菌经VITEK2 compact鉴定,94%概率,低分辨率。因鹑鸡肠球菌也有动力,生化特征相似,二者鉴别试验见表3,表型特征图示见图3。



铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌均对万古霉素天然低水平耐药,而粪肠杆菌和屎肠球菌对万古霉素是获得性耐药,这两类肠球菌的鉴别对临床治疗有重要意义。


二、质谱仪鉴定的结果差异及鉴别


质谱仪比自动化鉴定系统可鉴定的微生物种类和数量有很大扩展,但仍然存在鉴定某些的菌属/种、菌群的细菌时有差异[2],需要补充试验进一步鉴别,以下举例说明。


1. 阴沟肠杆菌阴沟亚种鉴定:阴沟肠杆菌阴沟亚种经某种质谱仪鉴定结果为:阴沟肠杆菌(置信度33.3%)/神户肠杆菌(置信度33.3%)/阿氏肠杆菌(置信度33.3%),三者都是同一个属的不同种菌,说明该菌的质谱特征图谱不典型,需要进一步鉴别。三种菌的鉴别试验见表4,若VP试验阳性,报告阴沟肠杆菌阴沟亚种。



2. 肺炎链球菌与缓症链球菌群鉴定:肺炎链球菌在血平板上α-溶血,典型菌落为“脐窝状”,如果是产生荚膜多糖的菌株,可见菌落光滑、湿润;少数菌株的菌落与缓症链球菌群菌株无法区别,鉴别特征见表5,鉴别反应及结果图示见图4。



3. 奥斯陆莫拉菌质谱仪鉴定:奥斯陆莫拉菌用不同品牌质谱仪的鉴定结果不同,质谱仪品牌甲报告:侵蚀艾肯菌(置信度99.9%);质谱仪品牌乙报告:奥斯陆莫拉菌;莫拉菌的鉴别特征见表1,鉴别反应及结果图示见图1。


【鉴别要点】根据过氧化氢酶(3%H2O2)试验阳性,排除侵蚀艾肯菌。


三、自动化微生物鉴定系统与质谱仪间的结果差异及鉴别


通过同一菌株在不同鉴定系统上的比对,大多数菌株的鉴定结果是相符合的,但少数菌株有差异。这种情况会导致实验室间、或者实验室在使用不同的鉴定系统时结果不符合,因此,针对鉴定结果与表型特征明显不符、存疑的菌株,实验室需要补充试验加以鉴别[3, 4, 5, 6, 7],以下举例说明。


1. 志贺菌属鉴定:目前的质谱仪对志贺菌属的菌株报告为大肠埃希菌,如果临床要求检查志贺菌属,推荐用常规的克氏双糖铁、动力试验的筛查。根据结果再用手工方法或微生物生化鉴定系统做鉴定,如果确定为志贺菌属的菌株,再进一步做志贺菌血清学分型确认试验。


使用VITEK 2 Compact上能够鉴定志贺菌,但质谱仪鉴定为大肠埃希菌,会造成漏检。志贺菌属菌株在不同鉴定系统中的结果差异见表6。



【鉴别要点】 手工或者微生物生化鉴定系统均可明确鉴定志贺菌属,但须经过血清学确认。应注意质谱仪对于来自粪便标本中检出大肠埃希菌的甄别,避免漏检志贺菌。


2. 大肠埃希菌O157:H7的鉴定:血清型O157:H7大肠埃希菌(E.coli O157)在麦康凯平板呈红色菌落(发酵乳糖),山梨醇麦康凯平板呈无色半透明菌落,不发酵山梨醇是E.coli O157与普通E.coli的重要区别,其在显色平板上呈酒红色菌落。动力阳性(80%),O157:NM血清型无动力。在KIA上发酵葡萄糖和乳糖、产酸/产气,氧化酶阴性,MUG(β-葡萄糖醛酸糖苷酶)和山梨醇均阴性。


E.coli O157:H7在VITEK 2 Compact上能够明确鉴定,使用某品牌质谱仪鉴定为E.coli,造成漏检。E.coli O157:H7在不同鉴定系统中的结果差异见表7,鉴别反应及结果图示见图5,血清凝集反应图示见图6。





【鉴别要点】 根据E.coli O157:H7山梨醇和MUG两项试验阴性,或使用E.coli O157显示平板可以快速筛查出来,菌株还需要生化鉴定和血清学或乳胶凝集试验确认。应注意质谱仪对于来自粪便标本中检出的大肠埃希菌的甄别,避免E.coli O157漏检。


该菌在血平板、巧克力平板上生长缓慢,菌落细小,35℃孵3天(空气环境)见针尖样菌落,孵育5天,菌落<1mm,不溶血。在鲍特菌平板上孵育4天的菌落>1mm、圆形、凸起、光滑,光照下的菌落水银滴样。为革兰阴性球杆菌,菌体似细砂,着色深。氧化酶和过氧化氢酶阳性,葡萄糖O/F:不利用,尿素酶阴性,硝酸盐还原酶阴性,无动力。与百日咳鲍特菌诊断血清凝集。VITEK 2 compact不能鉴定百日咳鲍特菌,VITEK MS质谱仪鉴定结果:百日咳鲍特菌(置信度50%)/支气管脓毒鲍特菌(置信度50%);需要对菌株做进一步鉴别,鉴别反应及结果图示见图7。



【鉴别要点】(1)百日咳鲍特菌生长缓慢,菌落细小,不能在麦康凯平板上生长,菌体细小,尿素酶阴性,可用特异性血清学鉴定。(2)支气管脓毒鲍特菌对营养要求不高,在麦康凯平板生长,菌体细长,尿素酶阳性,与百日咳鲍特菌有明显区别。


4. 新洋葱伯克霍尔德菌鉴定:新洋葱伯克霍尔德菌在血平板上35℃孵育24h,菌落细小。延长孵育时间菌落增大,圆形、凸起、光滑、湿润。革兰阴性杆菌、氧化酶阳性、葡萄糖O/F:氧化型。洋葱伯克霍尔德菌群种间的表型特征非常相似,即使补充试验鉴别,菌种的鉴定仍然困难,质谱仪有鉴别优势。新洋葱伯克霍尔德菌在VITEK 2 Compact鉴定结果:洋葱伯克霍尔德菌群(好的鉴定,94%);VITEK MS质谱仪鉴定结果:新洋葱伯克霍尔德菌(置信度99.9%)。如果需要进一步鉴定到种水平,鉴别特征见表8。



四、显色平板筛选及鉴别


显色平板专为目标菌的快速筛选而研制,是根据微生物特定的酶水解底物显色,且目标菌在此培养基上生长良好,显色快、色素鲜艳而容易识别。虽然显色平板中的抑菌剂会抑制“杂菌”的生长,但是,具有该种酶且能够生长的“杂菌”,会产生类似的色素,因此,不能仅仅根据色素而未经鉴定就直接发出报告,在表型特征不符合时,还需要进行鉴定确认,谨防误报。


1. 在念珠菌显色平板(科玛嘉)上生长绿色菌落的菌株:白念珠菌(ATCC10231)、都柏林念珠菌(质谱仪鉴定:置信度99.9%)在科玛嘉念珠菌显色平板上均形成绿色菌落 ,并且在血清中都产生芽管,容易混淆。因此,对绿色分离菌株需要进一步通过生化试验或自动化仪器鉴别。在念珠菌显色平板上产生绿色色素的不同菌种见图8。



2. 在头孢磺啶-氯苯酚-新生霉素(CIN)显色平板上生长红色菌落的菌株:CIN平板是筛查腹泻致病菌小肠结肠炎耶尔森菌(VITEK 2 Compact好的鉴定,98%)的显色平板,菌落呈红色。但可引起腹泻的气单胞菌属的3个种在这种培养基上也生长良好,菌落也呈红色,由于它们存在于粪便中,容易混淆,需要加以鉴别。在CIN平板上产生红色菌落的不同菌种见图9。



【鉴别要点】小肠结肠炎耶尔森菌氧化酶试验阴性,气单胞菌属氧化酶试验阳性。


3. 在无乳链球菌(科玛嘉)显色平板上生长红色菌落的菌株:除无乳链球菌外,解没食子酸链球菌巴斯德亚种(质谱仪鉴定:置信度99.9%)与表皮葡萄球菌(质谱仪鉴定:置信度99.9%)在无乳链球菌显色平板上生长,也是红色菌落。其中,表皮葡萄球菌对红霉素耐药,菌落小、生长慢。这两种菌株都分离自围产期孕妇阴道分泌物,因此,不能简单地把红色菌落作为无乳链球菌报告,需要进一步鉴别确认,误报无乳链球菌会对孕妇造成过度治疗。无乳链球菌过氧化氢酶阴性,CAMP试验阳性,作为特征性鉴定试验。在无乳链球菌显色平板上产生红色菌落的其他菌种见图10。



【鉴别要点】(1)解没食子酸链球菌巴斯德亚种是链球菌属的一个种,CAMP试验阴性可排除。(2)表皮葡萄球菌菌体排列、过氧化氢酶阳性可鉴别。


4. 在沙门菌(科玛嘉)显色平板上生长红色菌落的菌株:沙门菌产生辛酸酯酶,分解底物产生红色菌落,但粪便中还有其他菌种的细菌生长也呈红色菌落,容易与沙门菌属混淆,需要进一步鉴别。在沙门菌显色平板上产生红色菌落的不同菌种见图11。



【鉴别要点】(1)气单胞菌属与类志贺邻单胞菌氧化酶试验阳性可排除;(2)摩根摩根菌苯丙氨酸脱氨酶试验阳性可排除;(3)大肠埃希菌与志贺菌按常规方法鉴别。


本文仅列举了作者在日常工作中遇到的一些案例,当然,存在鉴定差异的菌株不仅限于此。当系统给出的鉴定结果为低分辨率或低置信度、不能区分的结果或给出多个结果、或对于一些少见菌用不同系统鉴定出现结果不一致等情况时,特别是无菌部位来源的标本、侵袭性方法采集的标本、免疫抑制患者等因素,应根据微生物的形态学、生理生化特性做进一步鉴定到种或亚种水平[2]。为临床报告正确的病原学结果,对临床治疗有重要意义。


参考文献略


注:本文来源于《临床实验室》杂志2020年第10期“感染性疾病”专题

来自: 检验视界网
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