不同的样本保存方式对流式细胞术检测淋巴细胞亚群结果的影响 ...

作者：李子安 张晓娜 阿祥仁

流式细胞术（flow cytometry, FCM）是利用流式细胞仪对处在液流当中的细胞或其他生物微粒的理化以及生物学特性（包括细胞大小、细胞表面抗原表达、DNA含量等）进行定量、客观、快速且多参数的相关检测^[1,2,3]。目前，应用FCM对血液中T、B淋巴细胞以及自然杀伤细胞（natural killer cell，NK Cell）亚群的检测在临床医学检验中已十分普遍，其对于机体免疫功能的评价、免疫性疾病的诊断、监测及预后都具有十分重要的意义^[4,5,6]。

FCM检测淋巴细胞亚群通常需使用新鲜的血液样本，从而保证检验结果的可靠性与准确性。同时，由于该技术影响因素较多，不同实验室对相同项目检测结果的可比性也往往不高。已有研究表明，使用不同的抗凝剂以及标本采集后不同的保存时间和温度对FCM检测健康人T淋巴细胞亚群的结果均有一定程度的影响^[7,8,9]。对于一些检测样本量少或由于其他条件的限制，样本在采集后不能立即进行检测的情况，了解标本存放的温度和时间对FCM检测淋巴细胞亚群结果的影响，不仅能有效保证实验室检测结果的准确性，还可在一定程度上节省人力和物力。

一、一般资料

选取青海省人民医院2018年10月26日至2019年3月30日住院和门诊患者样本共53例，包括男性28例，女性25例；年龄范围17~78岁，中位年龄42岁。所患疾病包括白细胞减少3例，慢性白血病6例，重症肌无力2例，发热4例，皮炎3例，肺部感染7例，传染性单核细胞增多症1例，类风湿关节炎3例，全血细胞减少5例，硬膜下血肿3例，狼疮性肾炎2例，多发性骨髓瘤2例，干燥综合征3例，免疫性血小板减少性紫癜2例，重症肺炎4例，肺癌3例。所有患者均知情同意。

二、仪器与试剂

1．仪器：

美国BD公司FACS Canto ^TM流式细胞分析仪。

2．试剂：

美国BD公司Multitest^TM IMK KIT4色淋巴细胞亚群检测试剂、配套溶血素以及原装鞘液；标记抗体的荧光素分别为：CD45-PerCP、CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE、CD56-PE、CD16-PE以及CD19-APC。

三、方法

1．样本的采集与处理：

用含EDTA-K₂抗凝剂的BD Vacutainer采血管采集患者清晨空腹全血2~4 ml，4 h内送至实验室并根据淋巴细胞亚群检测试剂说明书对流式细胞检测样本进行染色。样本分组如下：在样本采集后4 h内完成淋巴细胞亚群的检测，为对照组；处理组分为3组，A组为样本采集后4 h内进行细胞染色，然后分别于室温（22~25 ℃）环境下保存24 h、36h后再进行流式细胞术的检测；B组为样本采集后于室温下分别保存24、48及72 h后进行淋巴细胞亚群的检测；C组为样本采集后于4 ℃条件下分别保存24、48和72 h后进行淋巴细胞亚群的检测（对照组与处理组所用样本为同一患者样本）。

2．流式细胞仪的检测：

使用美国BD公司的配套CS&T质控微球进行仪器的性能状态监控；7color微球用于对仪器的荧光补偿、电压等参数进行调节。使用FACS Canto临床软件进行样本的获取和分析，检测过程严格按照仪器SOP文件和试剂说明书执行。

四、统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计并分析。单样本S-W检验用于数据的正态性分析，正态分布资料以

一、处理组A的淋巴细胞亚群检测

样本染色后，室温保存24 h检测的淋巴细胞亚群百分数结果与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），保存36 h之后检测CD3+及CD3+CD8+T淋巴细胞百分数明显升高[（74.28±11.31）%比（73.78±11.33）%，（32.15±14.82）%比（31.00±14.79）%；t值分别为-2.264，-5.639，P均<0.05]，CD19+细胞百分数显著降低[（15.60±12.23）%比（16.11±12.38）%；t=3.915，P<0.05]（表1）。

二、处理组B的淋巴细胞亚群检测

与对照组相比，样本采集后室温保存24 h检测的淋巴细胞亚群百分数结果无明显变化（P>0.05）；保存48 h后检测CD19+细胞百分数明显减少[（15.60±12.09）%比（16.11±12.38）%；t=2.209，P<0.05]，其他淋巴细胞亚群百分数结果无显著改变（P>0.05）；保存72h后检测CD3+及CD3+CD8+T细胞百分数显著升高[（75.78±11.18）%比（73.78±11.33）%，（32.57±14.90）%比（31.00±14.79）%；t值分别为-6.485，-5.461，P值均<0.05]，CD19+细胞百分数明显降低[（14.89±11.92）%比（16.11±12.38）%；t=4.511，P<0.05]（表2）。

三、处理组C淋巴细胞亚群检测

与对照组相比，样本采集后4 ℃保存24 h检测的淋巴细胞亚群百分数结果无显著改变（P>0.05）；保存48h后检测CD3+CD8+T细胞百分数升高显著[（32.03±14.95）%比（31.00±14.79）%；t=-2.610，P<0.05]，CD19+细胞百分数下降明显[（15.32±11.97）%比（16.11±12.38）%；t=2.151，P<0.05]；保存72 h后检测CD3+及CD3+CD8+T细胞百分数升高明显[（75.63±11.08）%比（73.78±11.33）%，（32.62±14.98）%比（31.00±14.79）%；t值分别为-4.978，-4.523，P均<0.05]，CD56+及CD19+细胞百分数降低显著[（8.21±6.52）%比（9.02±6.80）%，（14.83±11.79）%比（16.11±12.38）%；t值分别为3.197，3.081，P均<0.05]（表3）。

FCM检测淋巴细胞亚群，是通过白细胞表面的特异性抗原与特异性荧光抗体发生结合，进而对细胞的化学及物理参数进行检测与分析^[10,11]。血液标本存放时间过长对细胞的形态、大小以及表面抗原的活性等均可能产生一定的影响。

本实验室所用BD淋巴细胞亚群检测试剂盒说明书建议的样本检测为：储存在室温条件下的抗凝血须在样本采集后48h内染色，并在染色后24 h内进行分析。但是，也有部分实验室将不能及时完成检测的流式样本保存在4 ℃条件下。我们的研究结果发现，样本经染色后室温保存24 h检测的淋巴细胞亚群结果改变不明显，保存36 h之后检测CD3+及CD3+CD8+T淋巴细胞明显升高，CD19+细胞显著降低。样本采集后室温及4 ℃保存24 h检测的淋巴细胞亚群结果均无明显变化，室温保存48 h后检测CD19+细胞明显减少，4 ℃保存48h后检测CD3+CD8+T细胞升高显著，CD19+细胞下降明显，其他结果无显著改变；室温保存72 h后检测CD3+及CD3+CD8+T细胞显著升高，CD19+细胞明显降低，而4 ℃保存72h后检测CD3+及CD3+CD8+T细胞升高明显，CD56+及CD19+细胞降低显著，提示流式样本采集后室温保存为宜，且须在48 h内完成检测。陈潇等^[7]研究发现EDTA-K₂抗凝的健康人全血标本在4 ℃存放2 d及18 ℃存放3 d检测的淋巴细胞亚群结果均无显著改变；代艳超等^[12]研究样本存放时间对肝癌患者外周血淋巴细胞亚群影响时发现，经过预处理的标本在4 ℃条件下最多存放2 d，检测结果才不会发生显著变化。以上各结果与本研究结果均存在一定的差异性，这可能是由于标本来源（不同人群、不同疾病等）、样本例数、所用仪器、结果计数、统计方法等都不同所导致的。

综合以上研究结果，FCM检测淋巴细胞亚群时若不能及时完成，可将血液样本保存于室温环境下，并在48 h内完成检测；已经过预处理的样本，可在染色后室温保存24 h再进行检测，以上两种处理方式对检验结果均无显著影响。