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不一样的逆转录-热启动与耐高温

mango524 2023-5-8 12:00 AM 312人围观 医学



不一样的逆转录  ———— 



        研究表明双链核酸的结构稳定性依次为RNA:RNA> RNA:DNA>DNA:DNA (Biochemistry, Vol. 34, No. 34, 1995),对于普通单链RNA的逆转录,引物正常与RNA靶标退火,通过常规逆转录酶即可完成cDNA的合成,但是具有双链或二级结构的RNA其特殊的稳定性则阻碍了DNA引物与靶标的结合,导致逆转录效率降低。因此这给进行双链RNA的RT-qPCR检测或测序分析带来了问题:



?

For example:

问   题:

➡ 为什么有些RNA靶标的RT-qPCR引物设计筛选较困难?


➡ 为什么总RNA的cDNA合成存在一定的偏倚性?

为解决这些问题,提高双链RNA和具有二级结构RNA的检测效果,通常有以下三种解决方案:



!

For example:

方   案:

➡ 采用修饰的引物,提升引物与RNA结合的稳定性


➡ 热稳定的逆转录酶,高温打开RNA双链


➡ RNAseH酶靶向水解部分RNA链

或者在逆转录开始之前先加入模板和引物,高温变性之后进行引物退火,再加入逆转录酶体系。但显然该方法会增加操作步骤,使流程更为繁琐增加人工错误的风险。同时也也不能从根本上解决随机引物退火时的偏好性。

 

那么,针对这些问题与不甚完善的解决方案,我们真的束手无策了吗?答案是:不!并且,让我们把目光转向不一样的逆转录:


1

修饰引物解决方案示例




如下图所示,OxyS RNA 存在多处发卡结构,当设计引物从3‘末端进行逆转录时,根据电泳条带,DNA引物无法与靶标退火形成双链复合物,而当DNA引物部分碱基替换为LNA后,由于Tm值的提升,可成功与靶标RNA结合,进而完成逆转录反应(Biochemistry 2009, 48, 514–516)。

2

热启动高温逆转录解决方案示例




自然界中存在多种双链RNA病毒具有人畜致病性,如轮状病毒是引起6个月~2岁婴幼儿严重胃肠炎的主要病原体,占病毒性胃肠炎的80%以上。


在过去的一年我们成功推出了一款具有变革意义的RT-qPCR预混液,当市场目光聚焦在可冻干、样本直扩的同时,我们针对RT-qPCR中逆转录酶无法耐受高温的局限进行了革命性的改进,使得全新的一步法RT-qPCR预混液逆转录前可耐受85℃高温,具有独特的热激活逆转录功能,且在60℃-80℃之间保持同样优秀的逆转录活性。


以上特性可以更好的帮助客户避免非特异性扩增、更好的应对复杂RNA模板如二级结构和双链RNA病毒、实现更快的检测速度。


为了验证该预混液针对双链RNA病毒检测的优势,我们进行了如下实验。以A型轮状病毒(呼肠孤病毒科)分离的双链RNA(dsRNA)为模板,与竞争对手C进行比较。轮状病毒dsRNA在每个反应中连续稀释50000–5个拷贝,每个靶点浓度下重复6次。结果如图所示,相比于竞争对手,我们对于低拷贝模板具有更高的检出率。能够很好的帮助客户实现产品性能的进一步提升。

除耐高温逆转录特性之外,该预混液同样兼容可冻干、粗提样本直扩、高灵敏检测低至3拷贝、及多重RT-qPCR。




热启动高温逆转录RT-qPCR反应程序

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以上的“秘籍”,你get了没~





原作者: 小桔灯网
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