自2019年新冠疫情爆发以来，各级医院实验室及第三方检测机构陆续开展新型冠状病毒核酸检测项目。各种各样厂家检测试剂陆续上线，我科PCR实验室常规使用广州达安扩增试剂，内含两靶标基因：ORF1ab和N基因。
配制反应体系是PCR实验室工作人员每天必备的准备工作，我科起初一直都是人工配制：严格按照标准操作规程，解冻-混匀-离心-分装，自6月初起使用迈基诺移液工作站，开始仪器配制，如图所示：一周之后，质控结果失控（我科使用广州邦德盛质控品，浓度为9.91E+02copies/ml)，两靶标曲线频频未起，只起内标，如图所示：于是查找质控原因：围绕“人-机-料-法-环”展开进行排查。1、人：实验室操作人员均经过严格培训取得新冠核酸上岗合格证书，并有长期工作经验。人员并未变更，以往未出现过此类情况。2、机：我科使用济凡及中原全自动核酸提取仪，扩增仪为宏石96s，仪器均经过性能验证及比对实验，均合格。同样的一批标本分别在不同提取仪及扩增仪上进行提取及扩增，结果均失控。3、料：每批试剂与耗材均通过性能验证。使用同一批号扩增试剂，不同批号提取试剂（我科使用默乐提取试剂），进行实验，两靶标未起。后使用不同批号扩增试剂，同一批号提取试剂进行实验，结果依然如此。而且实验整体扩增曲线明显分层，呈离散型（但观察配制试剂液面呈平直状态），如图所示：4、法：质控品按规定保存于-80℃，每天使用前均取出放置室温半小时以上，待其完全融化后，震荡混匀离心进行提取，提取出的放入高压过的1.5mlEP管里，再放入2～8℃冰箱暂存使用（仅限当日）。将暂存4小时以上的质控品，及刚从-80℃冰箱内取出的质控品（严格按照标准操作规程提取），进行对比实验，结果仍未改变。5、环：实验室环境温度、湿度及各区压力均处于正常状态。综上分析：翻看最近失控批次整体扩增曲线离散度均较差，但此批号试剂性能验证结果很好，如下图：使用仪器配制试剂之前从未出现过此类问题，于是将矛头对准了仪器配制试剂过程。仪器配制与手工配制试剂相比有两种耗材不同：吸头与分液槽，使用之前也都经过质检。吸头是一次性的，而分液槽是消毒后再次使用的。我们对分液槽的消毒方法：每日配制试剂结束后，用75%酒精进行全面喷洒，后紫外线消毒半小时以上。不同实验室人员使用酒精喷洒量不一。
为了验证自己的猜想，再次做了对比实验：使用同一批号达安试剂，分别用75%酒精消毒过的分液槽与新分液槽进行试剂配制，后进行提取—扩增等一系列操作，结果如下：使用75%酒精消毒过的分液槽结果失控，新分液槽配制试剂的结果在控。最终失控原因：竟是酒精惹的祸！随后我科实验室改善分液槽消毒方式为使用清水清洗，后紫外线照射半小时以上，室内质控均在控。此次失控之旅就此画上圆满句号。
针对此次事件，我查阅了相关资料: 2019-nCoV 核酸检测试剂盒阳性质控品一般为含新型冠状病毒目的片段和内标片段的假病毒，其操作和处理应视为具有传染性的物质。新冠病毒对热敏感，75%酒精等脂溶剂也能杀灭病毒，故选择56 ℃水浴30 min，60 ℃干浴30 min，75%酒精处理3种方式灭活样本。较为常用的乙醇沉降或84 消毒策略能够将绝大部分核酸清除掉，但还有少量残留未能清除干净。同时乙醇只能通过被动接触核酸使其沉淀。医用乙醇一般为 700~750 mg/L。乙醇通过使病原微生物的蛋白质变性达到消毒效果。当使用的乙醇浓度过高时，菌体表面会形成一层荚膜来阻止乙醇进一步破坏其内部结构，而当使用的乙醇浓度过低时，也会因为乙醇的挥发作用等导致消毒效果不理想。乙醇可通过物理沉降和非直接破坏作用达到抑制或清除核酸污染的效果。
新冠核酸病毒检测是一项繁而细的工作，实验室需严格把控每一环节。为每一位患者负责，为每一份标本负责，做一名合格检验人。强化质量意识，确保检验准确性。
【参考文献】
［1］李云龙,张健,魏艳秋等.分子诊断实验室去除核酸污染的方法学研究[J].生物工程学报,2021,37(02):673-679.DOI:10.13345/j.cjb.200390.
［2］文纤纤，彭孝斌，杜栩彬等．3种灭活方法对新型冠状病毒核酸检测结果2020,35(06):61-64.DOI:10.13215/j. cnki . jbyfkztb .2008006.
［3］安超，施嘉楠等 《西安交通大学学报（医学版）》 2022年43卷2期 273-277页。
