如何解读“薛定谔的弱阳性”样品

    我常常羡慕孩子眼中的二元世界，非黑即白，好人和坏人，美丽和丑陋，对事物的判断不会有丝毫犹豫。对于检测结果大多数也是二元的，阳性或阴性。可是成人的世界里哪有那么简单，弱阳性或者可疑的检测结果作为一种处于量子状态的比“薛定谔的猫”还神秘的阳性分分钟让检测人员怀疑人生。今天结合我的一些经验，跟大家一起分享一些弱阳性样品判读的原则。

一、排除污染和非特异扩增

    本文讨论的所有前提都是建立在实验室处于一个正常受控的状态下，检测的各个环节都经过验证，检测结果准确可靠。

这部分的内容大家可以查阅本公众号的#检测全流程质控控制系列#文章。

预防核酸污染可参考如何预防和处理PCR检测实验室的核酸污染？

实验室建设可参考医学实验室设计与建设基本要求

防止假阳性结果参考核酸检测中的假阳性与假阴性之辨！

二、检测阳性结果的确认

    严格按照试剂说明书和SOP操作，保证检测结果的准确性，这样即使出现弱阳性结果也可以确定是阳性，有条件的可以使用更精确的方法进行确认，如荧光定量PCR的结果可以使用数字PCR进行确证。

1拷贝模板的检测

三、评估检测系统的最低检测限

1.LOB、LOD和LOQ

    每一个检测体系都有其固有的性能，因此需要使用标准物质或标准样品盘对检测系统进行评估，以确定其LOB、LOD和LOQ。对于qPCR和ELISA等定性方法需要LOB和LOD的评估，对于定量方法需要LOB、LOD和LOQ的评估。

LOB(Limit of blank), 空白检测限，指用空白样本去测试，在一定的概率下能测得的最高测量结果。

LOD(Limit of detection), 最低检测限，通常指对低浓度的分析物样本进行测试，在一定的概率的条件下能测得的最低值。

LOQ(Limit of quantitation), 定量限，通常指用低浓度的分析物样本进行测试得出的较低的值，这个值的准确性是有要求的，就是不光要能测到，而且还要保证结果是准确的。

当样品浓度低于LOB是无法检出的；

当样品浓度高于LOB而低于LOD，是无法稳定检出的，检出即为阳性；

当样品浓度高于LOD而低于LOQ，可稳定检出的，无法准确定量；

当样品浓度高于LOQ可精确定量。

2.核酸检测的LOD

可参照诊断试剂评价系列2-核酸检测方法（更正）

3.血清学检测的LOD

可参照诊断试剂评价系列3-血清检测方法

四、确定检测样品中的病毒含量

    检测就像用秤去秤东西，首先要知道秤的量程，最低就是LOD了，然后需要大致了解要称量的东西的大概重量，是棉花、木头还是钢材，非要用称钢材的秤去称少量的棉花那结果也一定是不准的，或者你明明把棉花放到秤上了但是显示是零。这就不是检测的问题而是试验设计的问题。但是现实是我们检测实验室被要求必须用高性价比（便宜）的试剂盒去测每毫升几个拷贝的病毒，还要求我们给出明确的结果。所以才有了本文对弱阳性样品的强行判定。不同类型样品病原含量可以从文献、同行交流或者历史检测数据获得相关信息。

引自（Pan Y, et al. Viral load of SARS-CoV-2 in clinical samples.The Lancet Infectious diseases ）

五、尽量一网打尽所有病原

    对于核酸检测来说模板含量越低能检测到的概率就越低，因此LOD通常为95%的概率可以检出，但是我们遇到的情况是需要我们判定模板含量高于LOB而低于LOD的部分。

    如下图，50微升的核酸中一共只有3个模板，如何能保证检测到模板？这其实是一个很不专业的问题，标准答案是如果我的试剂盒的LOD是200 copie/mL,样本中模板含量只有60 copie/mL，我当然检测不到了。很不凑巧你的老板不懂专业，必须要你给出结果，样品中到底有没有模板？我的建议是多次采样检测和将每次50微升的核酸全部进行扩增，有2次检测为阳性基本可以确认样品中含有模板。

六、选择合适的试验策略

1.平行试验 Parallel test：

    多个检测项目，只要有一个阳性即诊断为阳性，此法提高了敏感性，但降低了特异性，即减少漏诊率，提高了误诊率。当漏掉一个阳性后果严重时或再进行筛检费人力、物力时，要尽量减少漏诊率，则可采取平行试验。俗话说就是宁可错杀一千不放掉一个。但是当进行足够多的平行试验时，每份样品都是“阳性”。

2.序列试验 Serial test：

    多个检测项目，必须全部为阳性才能诊断为阳性。此法可以提高特异性，降低了敏感性，即减少误诊率，但却增加了漏诊率，当误诊能造成严重后果，如不必要的、昂贵的或者有创治疗时，应该用序列试验。但是当进行足够多的序列试验时，每份样品都是“阴性”。

七、结合临床的实际情况

同时对同一宿主的不同部位（如鼻拭子、口腔拭子、全血、肛门拭子、精液等）采样检测；

过一段时间后进行采样复测；

结合同群动物的检测情况；

结合核酸检测和抗体检测结果；

技术手段和风险管理手段相结合。

小结：本文的一些内容有点违背检测的原则和科学规律，但是我们检测人又不得不面对和解决这样棘手的问题。希望本文能对有这方面困惑的同仁有所帮助。