化学发光免疫分析方法（下）

3.3 高灵敏化学发光免疫分析方法

在实际检测中，现有的检测手段灵敏度和特异性不够理想，高灵敏高选择性的检测方法越来越显示出其重要性。纳米技术的发展为高灵敏化学发光免疫分析方法的发展提供了契机，纳米粒子在生物标记分析得到了广泛应用，已有多种信号放大方法用于高灵敏免疫分析方法的构建。

Zhang 等发现不同粒径的AuNPs 可以增强鲁米诺过氧化氢体系的化学发光，其中38 nm 粒径的AuNPs 增强效果最明显。Wang 等合成了特殊形状的不规则金纳米粒子( IGNPs) ，并且发现IGNPs对鲁米诺过氧化氢化学发光体系的催化活性是球状AuNPs 的100 倍，同时他们将抗体固定在IGNPs 表面，形成夹心免疫复合物。由于IGNPs 的催化活性，在无酶的情况下，加入化学发光底物即可得到化学图7 基于酶标抗体功能化的AuNPs 信号放大的超灵敏化学发光免疫分析方法发光信号。

Ambrosi 等提出了双编码的AuNPs 用于放大免疫分析信号，即在AuNPs 表面连接大量HRP 标记的抗体。由于HRP 具有催化活性，因而能显著增强信号。Yang等将这种双编码的标记物用于放大化学发光信号，同时在发光体系中加入增强剂对碘苯酚，进一步增强信号。以AFP 为检测模型，线性范围为0．008 ～ 0．3 !g /L，检出限为5 ng /L，如图7 所示。AuNPs 的粒径较小，不能负载足够多的酶，因而研究者尝试用更多的纳米材料负载大量的酶。Bi等采用了多层酶包裹的纳米碳管作为标记物放大化学发光检测信号。先将多壁碳纳米管用酸处理使其表面带有羧基，用层层组装方法将多层邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯( PDDA) 与HRP 吸附在碳纳米管表面，标记抗体后进行免疫反应形成免疫复合物。这种层层吸附的方法使得标记物连接了大量的酶，线性范围为0．02 ～2．0 !g /L，检出限为8．0 ng/L，比传统方法低2 个数量级。

图7 基于酶标抗体功能化的AuNPs 信号放大的超灵敏化学发光免疫分析方法

由于酶标抗体的位阻较大，研究者将酶直接连接到纳米材料表面，再以一定的比例固定抗体，既能连接大量酶，又减小位阻。Wu 等用HRP直接标记硅纳米粒子，发展了新型高灵敏的免疫检测方法。首先用晶种生长的方法合成SiO₂纳米粒子，粒径为( 103 ± 7) nm，然后用环氧丙基醚丙基三甲氧基硅烷作为交联剂处理硅纳米粒子，从而分别连接HRP和AFP抗体。采用两步夹心免疫法，第一步免疫反应结束后，将HRP 功能化的硅纳米粒子信标注入流通池，保证免疫反应导入酶量的最大化，从而实现信号增大。硅纳米粒子还能降低物理吸附，进一步提高检测灵敏度。检测线性范围为0．01 ～3．0 !g /L。与传统夹心免疫方法相比，该方法信号增强了61 倍，具备高灵敏度和可重复性。该方法简单方便、低耗、特异性好，可以推广到临床运用。利用三维有序SiO₂纳米多孔膜的高负载量。Yang 等提出了一种新的高灵敏化学发光免疫分析方法。该多孔的SiO₂膜以聚苯乙烯球( PS) 为模板，通过在玻璃片表面自组装沉积5 nm SiO₂纳米粒子，然后煅烧除去模板制得。以γ-缩水甘油醚丙基三甲氧基硅( GPTMS) 为交联剂，可将SiO₂纳米多孔膜进行链霉亲和素的功能化，与生物素标记抗体结合，制得的化学发光免疫传感器( 图8)。多孔膜可以促进免疫试剂的传质，因而制得的化学发光免疫传感器具有宽的检测线性范围、快的分析速度与良好的重现性和稳定性。以糖类抗原( CA 125) 为模型分析物，其线性范围为0． 5 ～ 400 U/mL，可达3 个数量级，而不用三维有序SiO₂纳米多孔膜为载体的免疫分析方法，在相同条件下的线性范围仅为5～40U/mL。

图8 功能化三维有序SiO₂纳米多孔膜为载体的化学发光免疫分析方法

天然酶在保存过程中结构的变化很容易丧失催化活性，纯化天然酶的昂贵代价也制约了它们的应用，而且天然酶的催化活性也会因为大分子肽包埋活性位点而被制约。研究者努力制备人工模拟酶用于信号放大，新型的信号增强技术，如DNA酶放大技术、滚环扩增法以及杂交连锁反应等不断涌现，但目前还没有运用到化学发光免疫检测中，这也为新型化学发光免疫检测方法提供了机遇。

4 发展与展望

化学发光免疫分析法具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、设备简单等优点，近年来在环境、临床、食品、药物检测中得到了广泛运用。实际检测常常需要对大量、复杂、低丰度的样品进行测定，因而化学发光免疫分析法逐渐向快速、高通量、高灵敏检测的方向发展。本文总结了近几年化学发光免疫分析法的应用进展，涉及到降低温育时间，多组分检测，以及信号放大技术。这些例子都证明了化学发光免疫分析法具有广泛的应用前景和可操作性。

此外，化学发光成像技术、化学发光免疫分析与分离技术的联用，可以使免疫分析的选择性、灵敏度和检测速度、检测通量得到进一步提高。为了更好地适应临床、环境等领域的实际应用，需要大力发展微型化、集成化和自动化的化学发光免疫分析仪器。随着分子生物学及纳米与传感技术的进步，新的化学发光免疫分析原理与高灵敏的免疫分析方法将得到不断发展，开发催化活性更高、稳定性更好、发光动力学曲线更符合免疫分析的酶和底物并推广到临床检测，发展新型标记技术用于信号放大，建立化学发光免疫分析新方法，都将是未来的发展方向及研究重点。

参考

1.汪晨. 化学发光免疫分析方法与应用进展.2018

2.LixiaZhao. Chemiluminescence immunoassay.2009