检验医学与感染病学（二）——细菌感染的检验

        作者：黄山

单位：贵州省临床检验中心

细菌是一大类能在人工培养纂中生长的原核细胞型微生物，各种细菌都有一定的形态、染色特性、生化反应和抗原结构。通过对标本直接显微镜检查、病原菌的分离培养鉴定、病原菌的抗原检测、核酸检测和细菌感染后机体免疫应答产物的测定及抗菌药物的敏感性试验，对细菌感染性疾病作出及时、准确的病原学诊断。在检查项目中，标本涂片和镜检对疾病诊断具有一定意义；分离培养和鉴定可作出病原学的确诊；在无菌标本中，如血液中检查到细菌，则此细菌为感染的病原体。对某些有正常菌群存在的感染标本所检测的细菌难以区分是污染菌或病原菌时，常采用定最培养菌落计数加以区分，如尿液中分离到革兰阴性杆菌，若定量在105cfu（菌落形成单位）/mL以上，则可判定为尿路感染，否则需要慎重判断或重复检测。由正常无菌部位采取的标本接种于血琼脂平板，置空气或含5%~10%CD2的大气中培养，大部分医学上重要的细菌24~48h内生长良好，而怀疑某些苛养菌感染时，应当酌情增加培养时间，以便提高检出率。

（一）检测程序

临床细菌学检测程序见图12-1。

（二）显微镜检查

1.染色标本显微镜检测

（1）革兰染色：革兰染色和显微镜检查是细菌感染快速诊断的简单方法，用于各种渗出液、尿液、脑脊液的细菌检查。标木涂片，固定和革兰染色后，首先用低倍视野镜检，若含很多上皮细胞，炎症细胞无或很少，常提不非炎症部位或标本在采集过程存在问题；根据染色性和细菌形态，常可以对细菌的属或种作出推测性鉴定，提供进一步采用的选择鉴别培养基。

（2）抗酸染色：抗酸染色适用于分枝杆菌枪查，用碱性苯酚复红染色后，具有耐强酸乙醇脱色能力的抗酸染色阳性细菌能够在标本中很好识别，对诊断结核病或其他非结核分枝杆菌细菌感染具有重要意义。此外，还可以检查腹泻患者的粪便中隐孢子菌等感染的孢子菌病和致病性诺卡菌。

2.不染色标本显微镜检侧

（1）湿片悬滴法检测：借助暗视野显微镜或相差显微镜观察标本中病原菌的生长和运动方式，有助于疾病病原体诊断。当米泔水样便中见有鱼群样运动活泼的弧菌，常提示为霍乱弧菌感染。

（2）湿片细菌计数：湿片高倍视野镜检尿液，若每高倍视野发现1个或1个以上细菌，则提示其可能为尿路感染病原菌。

（三）分离培养

分离培养是细菌学检查的关键，其目的是从临床标本中找出活的细菌甲进一步进行鉴定，确定其致病性和耐药性，指导抗菌治疗和预测治疗效果。不同细菌培养所需条件及生长特征各异，因此，必须根据临床要求、送检标本的性质和培养目的，选用不同的培养基，不同的接种方法和培养条件。

（四）鉴定

鉴定是指对标本中分离的细菌按分类原则放入某系统合适位置，是细菌分类的实验过程。常见的鉴定方法包括生化鉴定、血清学鉴定、数码鉴定、自动化鉴定等。其中自动细菌培养鉴定仪已广泛应用于临床微生物学检查，有Auiomicrobic（AMS）、Autobac（IDX）、MicroScan等系列，目前应用较广泛、自动化程度较高、功能齐全的有VITEK-AMS，Walkaway等系统。该系统采用数码鉴定原理，将测试卡内生化反应的阴阳性结果转换数字，以每3个生化反应为一组，得出10位数码（如测试卡需另加试验得到11位数码），将其结果与数据库中己知分离单位比较，获得相似鉴定值。该系统还可作药物敏感性试验，通过待测菌在各浓度抗生素小孔中的生长情况，经回归分析算出细菌最小抑菌浓度（MIC）。系统自动打印出实际报告，包括细菌种名，抗生素MIC灵敏度、尿液中可达到的最高药物浓度，常规用药剂量等内容的报告。

（五）核酸检测

PCR技术适用于以下细菌感染诊断：①人工培养基上不能生长的细菌和营养要求高不易培养的细菌，如麻风杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌。②生长缓慢的细菌，如结核分枝杆菌属细菌。分析其热休克蛋白hsp65片段。③多种细菌混合感染的诊断。

此外，随着微生物核糖体数据库的日益完善，16S rRNA序列分析技术已应用于临床微生物多样性的分析，采集临床标本。通过细菌16S rRNA通用引物PCR扩增其对应序列，直接对PCR产物进行测序，分析鉴定其对应细菌的种属。

（六）抗体检测

抗体检测通用于经抗生素治疗后或慢性细菌性感染，因为此时病原体的分离培养常为阴性，可用抗体检测诊断感染。由于感染后的抗体反应相当复杂，因此抗体检查结果需考虑其特异性和敏感性。一次性较高效价抗体并不能完全说明问题，应同时枪测双份血清（1份为急性期，1份为1周或数周后的恢复期），效价4倍增长，说明曾有感染。因此，血清学诊断更适用于流行病学调查。利用血清学方法诊断细菌感染有肥达反应、抗链球菌溶血素“O”试验、检查兔热病和波浪热的凝集反应、检查军团菌病的荧光抗体试验等。

（七）细菌毒素检测

1.外毒素检测

有生物学法、免疫血清学法和PCR法及自动化仪器检测法。

（1）生物学法：操作复杂，且不易获得敏感动物，动物的个体差异影响结果判断，只有在发现新的毒素的特殊情况下采用。

（2）免疫血清法快速、灵敏、特异为该法优点。且可进行大样品量筛选。有沉淀反应、颗粒凝集试验和免疫印迹试验等。

（3）核酸和基因诊断技术：基因探针技术可检查单个菌落产毒素性质，通常取病原菌染色体或质粒毒素基因片段制备成探针，利用放射性核素或非放射性生物系统标记，以检查未知标本，如检测霍乱肠毒素（CT）、耐热肠毒素（LT）和不耐热肠毒素（ST）等。PCR检测毒素不需要培养细菌，操作简单，目前可检测葡萄球菌各型肠毒素、α溶血素、β溶血素、白喉毒素、炭疽致死因子等30余种毒素。

（4）自动化检测法仪器：仪器均根据微生物形态、代谢产物和血清学反应设计，包括细胞颗粒计数仪、光散射测定仪、颜色改变浓度仪、薄层扫描仪和荧光光度计等。近年来发展的生物传感器利用免疫磁性电化学发光传感器检测葡萄球菌肠毒素、肉毒素和霍乱肠毒素等获得成功，可检测到飞克水平。

2.内毒素检测

革兰阴性菌的极小量内毒素（LPS）可引起广泛生物学作用，因此，对LPS检测有利于判定细菌感染严重程度，及早预防和发现内毒素休克的发生。

（1）家兔热原试验（RT）：一种经典的定性检测方法，是将定量的被检测标本通过耳缘静脉注入家兔体内，观察家兔注射后体温变化，判断是否存在LPS。

（2）鲎试验（LAC）：是目前检测LPS最敏感方法。可检测微量的LPS（0.01~1µg/mL）。可广泛应用于革兰阴性菌感染的快速诊断，对患者的血液、尿液及脑脊液可进行直接检查。

细菌耐药性的日趋严重，临床迫切需要进行抗微生物药物敏感性试验。耐药菌株在引起感染性疾病的革兰阳性球菌中，常见的是金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌等。表现为对甲氧西林、氨节西林、环丙沙星，红霉素、克林霉索、复方磺胺甲唑等抗菌药物不同程度耐药或多重耐药，如耐甲氧西林葡萄球菌（MRS），耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）、耐万古霉素肠球菌（VRE）和高度耐氨基糖苷类肠球菌。革兰阴性杆菌引起的感染以肠杆菌科和非发酵菌居多，主要耐药类型有β-内酰胺酶介导的耐β-内酰胺酶类抗生素的革兰阴性杆菌；质粒介导的产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌；染色体或质粒介导的产头孢菌素酶（AmpC）的阴沟肠杆菌和产气肠杆菌等；另外多重耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和不动杆菌等都已成为临床上感染性疾病治疗的棘手问题。细苗耐药的检测项目主要有以下几种。

1.抗微生物药物敏感性试验

抗微生物药物敏感性试验（AST）是对敏感性不能预测的临床分离菌株进行体外药敏试验，以指导临床选择治疗药物和了解社区或医院内常见病原茵耐药性变迁，有助于临床经验性治疗选药。同时耐药谱分析分型有助于某些菌种鉴定，为医院感染流行病学调查提供依据。

2.耐药菌检测试验

临床上常对一些特殊的耐药菌检测/监测，以便指导临床合理选用抗菌药物和监控医院感染动态。

（1）β-内酰胺酶检测：用于检测产β-内酰胺酶细菌耐药，比常规药敏试验可提前24~48h获得结果。检测方法有微生物活性消失法、碘-淀粉测定法、酸度指示剂法和产色头孢菌素法。以产色头孢菌素法为临床实验室最常用方法，只需将Nitrocefin商品化纸片用蒸馏水湿润，点种菌落，30min内变红色者即为阳性。

（2）ESBL检测：ESBL水解的底物除第一、二代头孢菌素外，对第三代头孢菌素（头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松等）和氨曲南均有作用，它的检测可用微生物学、生物化学和分子生物学方法进行。临床上广泛应用微生物学法，后两者目前仅用于实验室研究。微生物学检测ESBL方法有双纸片协同试验、三维试验和E试验等，这些方法各有优缺点，其中因双纸片协同试验操作简便、结果可靠、成本不高，是临床上较常开展的项目。

（3）MRS筛选试验：常用纸片扩散法、稀释法和琼脂筛选法，前两项为常规的药敏试验方法，琼脂筛选法因其结果可靠，简便易行为临床实验室常用方法。在含40%NaCl和6µg/mL苯唑西林的琼脂平板上，接种待测菌。35℃孵育24h，有细菌生长为阳性结果，示该菌为耐甲氧西林葡萄球菌。同时以标准菌ATCC2913、ATCC38519和已知阳性MRSA菌株作质量控制。

（4）耐青霉素肺炎链球菌检测试验：常用纸片扩散法作为过筛试验，再用稀释法或E试验作确定试验。当纸片扩散法测得的抑菌圈直径（苯唑青霉素纸片1µg/mL）＜19mrn时，提示该菌对青霉素耐药或中度敏感，再作MIC测定，MIC≥2µg/mL为耐药，以ATCC49619为质控菌株。

（5）氨基糖苷类高耐肠球菌检测试验：该菌的检测采用纸片扩散法和肉汤稀释法。当对庆大霉素纸片（120µg/mL）的抑菌圈直径≤6mm时，或MIC＞500µg/mL时可判为耐药；当抑菌圈直径在7~9mm时，可进一步采用肉汤稀释法或琼脂稀释法测定MIC以明确是否为耐药。以ATCC29212和ATCC51299为质控菌株。

病原体及其代谢产物进入人体后刺激机体免疫系统，产生相应的抗体，可利用多种免疫学方法对其进行检测（有时也检测病原体的抗原成分），帮助某些感染性疾病的诊断或早期诊断。近年来可以利用聚合酶链反应（PCR）或DNA探针分子杂交技术对病原体的核酸进行检测，帮助确定病原学诊断。