经皮肺穿刺标本临床微生物检测流程及质量控制专家共识

肺部疾病的发病率逐年上升，尤其是肺部感染性病变及肺肿瘤的高发，严重威胁人类健康和生命安全。CT引导经皮肺穿刺活检术应用于临床已有近40年的历史，是一项安全、微创的非血管介入性技术，在肺部疾病的诊疗中发挥着重要作用^[1]。目前肺穿刺活检往往仅进行病理学检查，通过病理检查虽然能够明确大部分病变的良恶性，但对感染性疾病的诊断应用较少^[2]。此外，随着抗菌药物、激素、免疫抑制剂、肿瘤放化疗和环境等众多因素的影响，不典型肺结核、肺部侵袭性真菌病、病毒性肺炎和非特异性肺炎等特殊类型肺部感染的发病率日渐增高，由于这类肺部病变的临床症状或体征不典型，常表现为性质不明的肺结节性或弥漫性病变，仅依据影像学检查，易与肺癌、特发性间质性肺病等非感染性肺部疾病混淆而导致误诊，从而延误治疗。因此，这类肺部病变的诊断及鉴别诊断目前已成为临床上亟待解决的难题。针对此类肺部病变，常规的痰培养、血培养或肺泡灌洗液培养等传统方法在临床标本采集和病原学诊断等方面存在一定局限性，而CT引导经皮肺穿刺活检术可在肺穿刺活检时，取出适量肺穿刺组织或血性渗出液标本进行肺穿刺组织病理学联合微生物学检测。研究表明这种联合检测方案是提高肺部感染性疾病诊断准确性的可行手段，有助于临床早期诊断、及时治疗，对于改善患者预后具有积极作用，尤其是常规方法检测阴性的肺结核、肺部侵袭性真菌病及特殊类型肺炎的诊疗^[3,4,5]。然而联合检测方案至今尚未在业内形成共识，制约了肺穿刺技术在肺部感染性疾病诊断中的应用。因此，我们遵循循证医学原则，通过文献检索，专家讨论，结合临床实际制定本共识，供同道参考，并旨在应用中不断完善。

经皮肺穿刺标本临床微生物检测是指CT引导经皮肺穿刺活检术时获得适量肺穿刺组织或血性渗出液标本，对获取的标本进行涂片、培养、体外药敏试验及基因检测等过程。肺穿刺组织病理学联合微生物学检测适用于所有存在临床可疑肺部感染病灶、无穿刺禁忌证的无痰或痰液检查、气管镜刷片检查均未获得病原菌诊断依据的患者。

微生物检验结果准确性与实验前、中、后的全过程的标准化操作密切相关，过程中涉及患者、医师、护士、标本运送人员和检验人员等，因此需要相互沟通，密切配合。正确地采集、保存、运送及接收肺穿刺微生物检验标本，对于保证临床微生物检验工作质量至关重要^[6,7]。

（一）经皮肺穿刺标本采集

1．操作前准备：

应根据病灶特征，充分评估患者肺穿刺操作难度和发生相关并发症的风险。采集时间最好是病程早期、急性期，尽可能在使用抗菌药物前采集标本。若患者已使用抗菌药物，应在微生物检验项目申请单上注明应用的抗菌药物种类和名称。穿刺前进行肺部病变CT扫描，对孤立性病灶选择直径最大、密度较均匀的层面，对弥漫性病变选择病变集中、密度均匀的层面为穿刺层面，根据病变距胸壁最短距离确定患者体位为仰卧、俯卧或侧卧，利用CT机游标精确测量病灶与体表的最短距离并作标记，确定穿刺点及进针深度^[8]。

2．操作方法：

肺穿刺标本采集时，应注意对局部皮肤消毒，严格执行无菌操作，避免穿刺点被皮肤的正常菌群污染。根据CT引导下经皮肺穿刺活检术进行穿刺，用一次性精细活检针获取肺穿刺组织标本后，一部分置于含10%甲醛的容器内，送病理科进行组织病理学检查；另一部分置于含少量无菌生理盐水的容器或运送/保存培养基内，送实验室进行微生物学检测。若用注射器抽取肺穿刺血性渗出液标本，建议尽量多地抽取标本（同一部位多针穿刺），并将标本全部注入分枝杆菌/真菌培养瓶或血培养瓶中，如抽取的血性渗出液标本量较少，可抽吸培养瓶内肉汤反复冲洗针筒后将其全部注入培养瓶，根据肺穿刺标本微生物检测目的和肺部感染特点，注入培养瓶的优先顺序应为分枝杆菌/真菌培养瓶、血培养瓶。操作过程中要注意观察患者是否出现咳血、气促等并发症；操作完毕后，复查胸部CT，观察是否并发气胸^[9]。

3．注意事项：

采集肺穿刺标本时，采样医师应注意标本的性状、色泽及气味等，尽可能在微生物检验项目申请单上备注，为鉴定致病菌时提供参考依据。在不对患者造成较大创伤的情况下，应尽可能多地采集肺穿刺标本，若增加分子等其他检测项目，建议增加一针穿刺组织，防止标本量过少造成假阴性检验结果。

（二）经皮肺穿刺标本的保存及运送原则

CT引导经皮肺穿刺获取用于微生物培养的肺穿刺组织标本后，可在无菌容器中加入少量无菌生理盐水至浸没组织标本，以保持标本湿度及微生物活性。普通培养在室温保存，2 h内送检。若怀疑军团菌属感染，则无菌容器中不加生理盐水，并立即送检；若怀疑厌氧菌感染，建议采用床边接种方式，或及时送检，确保30 min内接种完毕，或置厌氧菌保存运送培养基，室温保存，2 h内送检。运送/保存培养基保存的肺穿刺组织或血性渗出液标本，可最大程度保持需氧菌、厌氧菌、分枝杆菌和真菌的活性及核酸的稳定性。低温保存可适当延长保存时间，若非工作时间或不能及时送检的标本，建议4 ℃冰箱保存，最长保存时间不超过24 h；接种分枝杆菌/真菌培养瓶或血培养瓶的肺穿刺血性渗出液标本，应室温保存。

（三）经皮肺穿刺标本的接收原则及不合格处理原则

肺穿刺标本送至微生物标本接收室后，微生物实验室接收人员应根据标本送检要求评估标本的合格性，主要检查标本外观是否有严重污染、容器是否有破损渗漏，是否有唯一标识，是否在规定时间内送检等，并记录标本的性状、色泽及气味等。

微生物实验室接收人员必须严格按照肺穿刺标本的接收原则进行评估，做好微生物实验室标本不合格记录；不符合要求的肺穿刺标本应立即与临床医师联系，报告标本不合格的具体理由，若临床仍需进行检验，须在报告上注明标本状态。肺穿刺标本常见的不合格原因及处理方法见表1。

表1 肺穿刺标本常见的不合格原因及处理方法

在"不合格肺穿刺标本处理记录表"登记相关信息，至少包括：标本唯一标识、患者唯一标识、采样医师姓名、采集日期和时间、不合格原因及性状描述、接收人员签名及时间。

检测内容主要包括一般细菌、真菌、分枝杆菌等病原菌的涂片镜检、培养、体外药敏试验、免疫学方法和分子生物学检测等^[10,11]。

（一）涂片染色镜检

由穿刺采样医师直接采用组织印片法或由实验室技术人员将肺穿刺组织研磨匀浆后制作涂片，进行各种染色镜检。如果怀疑毛霉目真菌感染，标本可用无菌刀片或剪刀分割为小块，不可研磨匀浆，防止破坏菌丝的完整性。涂片类型及其意义说明见表2^[12]。

表2 涂片类型及其意义说明

（二）微生物培养法

培养分为固体培养及液体培养。固体培养将肺穿刺组织标本研磨匀浆后接种于血琼脂平板、巧克力平板、厌氧平板、沙保弱或罗氏培养基等；液体培养则将肺穿刺血性渗出液标本接种至培养瓶，建议使用分枝杆菌/真菌培养瓶；若无分枝杆菌/真菌培养瓶，建议加做结核培养（米氏7H9肉汤）及真菌培养（脑心浸液肉汤），培养阳性的标本可进一步进行菌种鉴定和体外药敏试验。

（三）免疫学检测

免疫学检测根据免疫学及细胞生物学等学科的技术或原理，可将病原菌及其分泌物中特有成分作为一种抗原或抗体分子，从而进行定量或定性检测。如结核菌胶体金抗原检测的原理是利用免疫层析法来检测微生物培养法培养的菌株是否有结核分枝杆菌复合群特有的蛋白成分MPT64，以达到结核分枝杆菌复合群的快速鉴定。

（四）分子生物学检测

分子生物学检测如核酸分子杂交、PCR、基因芯片、蛋白印迹、质谱仪或全基因组测序等技术是利用标本中病原菌的核酸、蛋白质、多糖等生物分子进行菌种鉴定或耐药基因快速检测，可根据以上检测的结果同时结合临床症状做最终诊断^[13,14]。

CT引导经皮肺穿刺获取的标本通常为组织或血性渗出液，但标本量较少，为避免漏检，应该尽可能同时开展微生物涂片染色镜检、液体培养及分子生物学检测等多种检测手段；若标本量过少无法同时开展多项检测时，应联系临床，根据临床情况优先开展所需项目。若病原菌为普通需氧菌、酵母样真菌，需同时进行菌种鉴定和体外药敏试验检测；对于厌氧菌、结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌，根据临床需要和实验室能力确定是否进一步进行体外药敏试验；若为丝状真菌，仅报告鉴定结果，见图1。

图1 肺穿刺标本检测标准化流程图

（一）报告的内容与方式

阳性检测结果可参照危急值报告方式，及时通知临床医生；阴性检测结果则直接发阴性报告。

（二）结果的解释及临床沟通

1．临床意义：

本共识所建议的检测方案是为了提高经皮肺穿刺标本的阳性检出率，由于各种方法学皆有其自身的限制性，要对感染状况做出正确的诊断，需结合多种检测结果与临床症状进行综合判断。

2．感染与污染：

临床标本在采集或培养过程中可能因污染而检出其他非病原性微生物，会出现假阳性结果；标本送检超过规定时间或保存条件不当，会出现假阴性结果。因此，对采集得到的肺穿刺标本要及时送检并检测。同时，微生物检测结果需结合患者的临床表现和其他检查结果，包括肺部影像学检查（胸片、肺CT或磁共振等）和其他实验室检查结果，如血常规、C反应蛋白、降钙素原、1，3-β-D葡聚糖检测和半乳甘露聚糖检测等进行综合判断。阳性检测结果且排除污染的情况下，提示感染。

3．多重感染：

分枝杆菌/真菌培养瓶在培养过程中可能检出其他细菌或酵母样真菌，而且免疫力低下的患者很可能存在多重感染的情况，因此需要将培养瓶报警阳性之后的涂片结果联合患者其他微生物检测结果，再结合临床症状综合判断是否为污染或者多重感染。

4．检测时间：

由于不同病原菌生长速度不同，完成检测所需要的时间亦不相同；检出阳性结果的快慢与病原菌种类、含量以及标本中抗菌药物的有无、种类及浓度相关。分枝杆菌/真菌瓶建议培养时间为42 d；普通细菌培养建议培养时间为7 d，酵母样真菌检测时间建议延长至14 d，丝状真菌检测时间建议延长至28 d。

所有临床标本应采用无菌的密封容器运送至实验室。在操作过程中应注意规范操作，严格按照病原微生物实验室的防护规范做好个人防护。在混匀、研磨、接种及涂片等操作过程中，尽可能避免气溶胶的产生，必须在生物安全柜内进行操作。注射器、针头、剩余或废弃的标本等污染物需经121 ℃高压蒸汽灭菌30 min后，才能丢弃或清洗^[16]。

临床医生应按照检验项目申请程序申请微生物检验项目，仔细核对医嘱和患者信息，并进行正确的标本采集和处理。

标本运送人员应将肺穿刺获得的临床标本在规定的时间、温度及合适的运送条件下，尽快送达实验室。

临床实验室标本接收人员应按照要求接收或拒收标本。若怀疑特殊病原菌感染，应在标本接收时在微生物检验项目申请单上注明或与检验人员进行充分沟通。

临床微生物实验室检验人员应按照标准操作规程进行操作，同时进行室内质控和室间质评，确保所有检验流程的质量，包括染色、培养、鉴定和体外药敏试验及免疫学和分子生物学检验的质量。

执笔：陈栎江（温州医科大学附属第一医院医学检验中心）、赵虎（复旦大学附属华东医院检验科）

专家组成员

专家组成员（按姓氏汉语拼音排列）：陈栎江（温州医科大学附属第一医院医学检验中心）；胡继红（北京医院国家老年医学中心卫生部临床检验中心）；罗燕萍（解放军总医院医院医学检验中心）；马越云（空军军医大学第一附属医院检验科）；聂丽华（福建省汀州医院检验科）；苏建荣（首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心）；徐英春（中国医学科学院北京协和医院检验科）；赵虎（复旦大学附属华东医院检验科）；周铁丽（温州医科大学附属第一医院医学检验中心）

选自中华检验医学杂志, 2019,42(1)