谢国明教授：开发新型可调pH“开关”，助力肿瘤精准成像

生理条件下，细胞和组织内的pH值通过严格的稳态控制来维持。然而，局部pH值的变化在许多关键的生物过程中起着至关重要的作用，例如酶的催化、蛋白质的折叠、膜的功能以及细胞凋亡等。因此，开发能够对微小pH变化做出响应的分子系统，对于包括体内成像、临床诊断和药物递送在内的多种应用都具有重要意义。

DNA作为一种天然材料，因其易于合成、高度可编程性、智能响应性和卓越的生物相容性，已被广泛用于分子组装，构建各种复杂的纳米结构。这些DNA纳米结构已应用于生物诊断、生物治疗、纳米机器人、生物计算等多个领域。其中，i-motif结构作为一种次级DNA结构，在pH传感应用中展现出显著优势。

近日，重庆医科大学检验医学院谢国明教授、西南医科大学附属中医医院检验科郭永灿主任以及重庆医科大学附属第一医院神经外科杨刚主任团队开发出一种基于DNA的可调pH开关——影子链杂交驱动的置换工程（SHADE），通过设计i-motif 衍生的影子链和发夹影子链，实现对pH响应范围的精确调控，并在肿瘤微环境的酸碱度检测中展现出巨大潜力，有望为肿瘤的精准诊疗提供有力支持。该研究发表在Nucleic Acids Research（IF：13.1），也是团队今年发表在该杂志的第3篇文章。

01

SHADE的设计及工作原理

受分子伴侣在蛋白质折叠、组装、运输和降解中作用的启发，研究人员设计了i-motif形成序列的“影子链”。它能与阻断序列结合，帮助i-motif序列从双链结构中释放出来，从而在酸性条件下形成稳定的i-motif结构并产生荧光信号。

通过在阻断序列中引入A-C对，研究人员能够精确调控i-motif结构的折叠/展开中点（pHT），使pHT向更接近生理条件偏移。此外，该研究还设计了发夹影子链（HS），在中性或碱性条件下，A-C对的解离会暴露出脚趾结构域，启动链置换反应并产生荧光;而在酸性条件下，HS形成稳定的链内发夹结构，从而阻止链置换反应。通过结合i-motif序列和HS，研究人员开发出了一种窄pH响应探针，该探针在pH 6.5时表现出最佳荧光强度，而在pH过高或过低时，荧光信号则较弱。

图1 SHADE设计示意图

实验结果表明，与没有影子链的系统相比，引入影子链的系统在pH 5.0时的荧光信号显著增强，而在pH 8.0时则较弱。这证明了影子链在促进i-motif结构形成中的辅助作用。影子链对i-motif的辅助作用是可逆的，并符合链置换反应的规律。

图2 酸性条件下的SHADE

02

A-C对和发夹影子的设计

为了克服在较弱酸性条件下区分能力有限的问题，研究人员在i-motif形成序列和阻断序列之间引入了A-C对，以pHT调整到更接近生理条件。在pH值为5.0时，通过增加A-C对的数量，研究人员能够将pHT值提高至最高6.21，并且发现A-C对在阻断序列的5′端比在3′端对pHT的提升效果更好。这些设计使得探针能够在pH值为6–6.5、5.5–6.5或5.5–6.0的范围内进行重置，展现了通过DNA工程调节pH响应的能力。

此外，研究人员设计了含有A-C对和内部互补碱基的HS，用于在正常TMSDR系统中进行实验。在酸性条件下，HS的脚趾结构域被互补碱基封闭，阻止了TMSDR和信号的产生；而在中性或碱性条件下，A-C对的解离使茎结构不稳定，暴露出脚趾结构域，从而激活TMSDR。荧光动力学实验显示，在pH值为8.0时，信号显著高于pH值为5.0时的信号，证实了该系统对碱性条件的偏好。

通过将HS与i-motif形成序列结合，研究人员开发出了一种在pH值为6.5时表现出最佳荧光的窄pH响应探针。这种核酸探针对轻度酸性pH具有选择性响应与良好的可逆性，在临床应用中展现出巨大潜力。

图3 A-C对和HS链的设计

03

细胞外微环境中pH值的感知

研究人员首先在体外利用HeLa细胞评估了SHADE的生物相容性，并整合了核酸适配体模块以实现细胞表面锚定。研究表明，SHADE在酸性环境下（pH 5.0）荧光显著增强，而在弱酸性条件下引入A-C对后荧光强度进一步提升。HS介导的TMSDR在碱性条件下（pH 8.0）荧光更强。将i-motif序列与HS结合后，仅在pH 6.5时产生荧光，验证了SHADE对肿瘤微环境pH的精确感知能力。

图4 细胞外微环境中pH值感知

为了评估在实体瘤中的选择性和成像能力，研究人员进行了体内荧光成像实验。通过将HeLa细胞皮下注射到BALB/c裸鼠体内建立肿瘤异种移植模型，随后通过静脉注射Cy5标记的DNA序列（Apt-SHADE）。注射后2小时内，肿瘤荧光强度逐渐增加。改变pH敏感碱基的对照组（Apt-MSHADE）与另一组修改了适配体序列的对照组（MApt-SHADE）在肿瘤中的荧光对比度增加很少。

治疗后2小时，研究人员对肿瘤和主要器官进行离体成像，发现Apt-SHADE处理的肿瘤比对照组显示出显著更高的荧光信号。这些结果表明，带有适配体的SHADE能够同时感知肿瘤细胞表面和细胞外环境，为肿瘤的精准成像提供了有力工具。

图5 体内荧光成像实验

总之，SHADE策略的独特优势在于其能够精确调控pH响应范围，并在狭窄的pH范围内实现响应。这种精确的pH响应能力使得SHADE探针能够准确地靶向肿瘤微环境，为精准医疗提供了有力支持。

此外，SHADE策略还具有广泛的潜在应用前景，例如基因表达调控、DNA机器、水凝胶形成以及纳米颗粒组装等。结合其他药物递送技术，SHADE探针有望实现精准的药物递送。同时，将SHADE策略与其他分子传感器相结合，还有望实现对复杂分子现象的追踪，为DNA纳米结构在整体生物医学应用中开辟新的可能性。

文章链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkaf849

专家简介

谢国明 教授

临床检验诊断学教育部重点实验室副主任，医学检验微流控与SPRi重庆市工程中心学术带头人，重庆医科大学特聘教授，重庆医科大学附属第一医院双聘教授，博士生导师、博士后合作导师。University of Nevada, Las Vegas和University of Illinois at Urbana-Champaign访问学者。

国家科技奖评审专家，国家自然科学基金评审专家，国家科技部重大专项评审专家，重庆市科技项目评审专家，国家教育部学位论文评审专家，重庆市体外诊断技术创新战略联盟第一届专家委员会副主任委员。《分析仪器》杂志编委，Biosens.Bioelectron.X杂志客座编辑。

研究方向：临床分子检验与DNA动态纳米技术、液体活检与微流控芯片、POCT与生物传感器研究与开发。近8年主持国家重点研发计划课题1项、国家自然科学基金面上项目4项，重庆市科技项目3项。在Nucleic Acids Research、Journal of the American Chemical Society、ACS Nano等杂志上发表SCI收录论文60余篇。获得重庆市科学技术进步一等奖和四川省科学技术进步三等奖各1项,四川省优秀教学成果二等奖和重庆市优秀教学成果三等奖各1项。指导本科生获得中国国际“互联网+”大赛重庆市赛金奖3项，全国大学生基础医学创新研究暨实验设计论坛大赛国赛金奖1项。全国高等医药院校医学检验技术专业第五轮规划教材《临床检验仪器》（医药版，第4版）第一主编。