应用二代测序技术检测乳腺癌易感基因BRCA1/2、TP53和PTEN胚系突变 ...

二代测序技术相比传统一代测序技术有较大改革，具有通量高、准确性高、成本低等特点。目前已经成为分子生物学领域最重要的技术之一，在实体肿瘤基因组学、血液病肿瘤基因组学、遗传性疾病以及微生物学等方面的研究中得到了广泛的应用。乳腺癌目前已经成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，是导致女性死亡的最常见原因之一。我国乳腺癌的近些年发病率也在缓慢上升且发病年龄年轻化。

BRCA基因在DNA修复的同源性重组机制中扮演重要角色，胚系BRCA1/2突变将显著提高女性乳腺癌、卵巢癌以及其他癌症的发病风险。研究表明与遗传性乳腺癌相关的高外显性基因主要是BRCA1和BRCA2， 其次还有TP53、PTEN、CDH1、STK11。携带这BRCA1/2两种胚系突变的个体罹患乳腺癌的风险相比健康人高80%，并与早发乳腺癌密切相关。除此之外，TP53和PTEN这两个罕见高外显率基因也值得注意。有文献表明TP53突变携带个体，在74岁之前患乳腺癌的几率比健康人高25.7%。携带PTEN基因突变的个体患乳腺癌的几率高85.2%。同时乳腺癌相关的易感基因在不同种族间存在差异，以BRCA1/2为例，目前大部分数据来源于欧美国家人群，而中国人群的突变谱尚未完善。

本研究应用二代测序对128例乳腺癌患者的外周血标本进行BRCA1/2、TP53、PTEN 等多个基因全外显子的胚系突变联合检测，评估其与乳腺癌临床特点之间的关系，分析中国人群的突变情况，完善中国人群BRCA1/2突变谱，为乳腺癌的预防、相关遗传咨询及高危健康人群筛查提供依据。

本研究主要应用Ion Torrent S5测序平台，使用Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0和Ion AmpliSeq™ custom primer pools进行扩增子文库制备，扩增目标区域，片段化指定长度的扩增子，将指定长度的扩增子加Barcode，最后使用ABI7500及Ion Library Quantitation Kit 进行qPCR，对纯化后的文库进行定量。使用Ion Chef 完成模板制备及芯片上样，最后使用Ion Torrent S5进行测序。测序深度500×，在靶率>90%，扩增子均一度>90%，测序片段读长200-250bp，信号值>50，可用数据量>40%，多克隆与低质量测序比例<40%。并对重要突变位点进行了一代测序验证，具有较高一致性。

基因变异命名规则参照HGVS人类基因组变异协会（http://www.Hgvs.org）命名，核酸命名依据人类基因组变异学会( Human Genome Variation Society，HGVS) 命名法则，遗传信息解读标准依据美国医学遗传学与基因组学学会 ( American College of Medical Genetics and Genomics， ACMG) 遗传解读原则。致病突变位点与乳腺癌信息中心网站数据库( Breast Cancer Information Core， BIC) ( http://www.nhgri.nih.gov/Intramural _research/Lab_transfer/Bic/)、ClinVar数据库( http://www．nibc．nlm．nih． gov/clinvar/) 进行对照，明确是否为与疾病相关的新发突变位点。