方法学原理局限造成的底物耗尽假象

作者 | 胡晓强

单位 | 广州中医药大学顺德医院检验科

在用生化分析仪检测酶类项目时,常有一些高活性样本酶含量过高,导致反应体系中的酶的底物短时间内消耗完毕，使之后的反应吸光度变化近乎为零^[1]。

底物耗尽的处理也很简单，只需要用生理盐水（或去离子水）进行适当的稀释，然后乘以相应稀释倍数即可。值得一提的是，稀释并不是无限制的，稀释倍数越大引起的误差可能就越大，需要对试剂最大稀释倍数进行有效评估^[2-3]。

在检验日常工作当中，我们有时会遇到部分样本含有干扰物质的情况，但由于同种检测项目，方法学原理不同，抗干扰性不同，造成结果的差异^[4-6]。

本文将要讲述的便是生化项目中的丙氨酸氨基转移酶（速率法）检测，结果从底物耗尽到参考区间内数值的过程。

4月14日刚接晚班便遇到一个棘手的问题，某患者生化项目丙氨酸氨基转移酶（干化学速率法）LIS结果提示异常，仪器显示底物耗尽（图1）。

图1

正常来说，按照常规操作，样本经过生理盐水稀释后，结果就能计算出来，但是转折点就在这里。样本经过从低到高2倍、5倍、10倍稀释，结果分别为30U/L、37U/L、41U/L.（图2-4）；结果竟然从底物耗尽，变成系统可测量范围内数值，且稀释2倍结果竟在参考范围内的正常值。

图2

（该结果为生理盐水稀释2倍，但未在仪器设置稀释倍数，需人工计算，结果为30U/L)

图3

（该结果为生理盐水稀释5倍，结果为37U/L)

图4

（该结果为生理盐水稀释10倍，结果为41U/L)

经查看仪器内ALT线性范围为4-750 U/L,仪器上明明显示是底物耗尽，稀释后结果反而变成系统可测量范围内数值。排除仪器、试剂、标本性状问题后，查看了该患者电子病历及检验结果（图5-7），终于发现了一点端倪。

图5

图6

图7

该患者气促、胸闷、烦躁9小时余收入院，有高血压、糖尿病史，未规律服药，入院检查血糖结果为29.24mmol/L,报危急值，血气分析结果提示代谢性酸中毒。

正常有氧条件下，糖酵解在细胞溶胶中进行，是葡萄糖经过酶催化作用降解成丙酮酸，并伴随生成ATP和NADH的过程。它是动物、植物和微生物细胞中，不管在有氧或无氧条件下，葡萄糖分解的共同代谢途径。

糖酵解生成的丙酮酸进入线粒体，经三羧酸循环被氧化成CO₂和H₂O。酵解过程中产生的NADH，则经呼吸链氧化产生ATP和H₂O。而在无氧条件下，糖酵解产生的丙酮酸能够被NADH还原成乳酸，乳酸可以通过血液进入肝、肾等组织内，重新转变成丙酮酸，再合成葡萄糖和肝糖元，或进入三羧酸循环氧化。

经过分析此患者为糖尿病酮症酸中毒，糖酵解几乎停滞，血中堆积了高浓度的丙酮酸。而ALT（干化学速率法）反应试剂成分都集中在聚酯基材上，由于该试剂检测原理（图8）的局限性，丙酮酸物质浓度过高会加速该试剂氧化酶的转化，当实验开始时，内源性丙酮酸提前把第二步反应启动，干片内反应物质被消耗完，造成了底物耗尽的假象。

图8

为了进一步验证想法，作者更换了检测平台，用另外一种试剂检测该标本。该试剂检测方法学一致，但反应原理不同（图9）。最终该平台试剂检测结果为17.1 U/L（图10），结果反应曲线正常，无其他异常提示。

图9

图10

本案例中结合患者临床病历及检查结果，综合考虑了试剂方法学原理的局限性与干扰因素分析，实验室最终报出临床结果为17.1 U/L。

该案例中两种试剂虽然对于丙氨酸氨基转移酶的检测方法学都是速率法，但由于试剂反应原理不同，所以造成了前试剂初始结果为底物耗尽的假象。

工作中当我们遇到仪器或反应曲线提示底物耗尽，排查了样本前处理、硬件等问题后，除了进行生理盐水（或去离子水）适当的稀释，还要综合考虑方法学原理的局限性及干扰物质的影响，及时更换平台检测，如检测结果不一致，需结合患者病历及其他检测结果具体分析。

该案例为本院的真实临床案例，在此体现出作者积极且严谨的工作态度，临床与检验相结合的工作经验。虽然当前检验项目日新月异，但是对他们临床方法学原理及性能深层次的挖掘，是我们检验人员必不可少的工作任务。检验科是基础医学和临床医学之间的桥梁，检验技师是挑夫也是研究员，检验人员不以报告单上那句“仅对本标本负责”而推脱责任。本案例真实、可靠，结合临床病历与和检验结果通力是本案例体现出的最大价值，值得分享。

点评专家：李琳，主任技师

单位：广州中医药大学顺德医院 检验科

参考文献：

[1]闫家微;张启全;成松.全自动生化分析仪ALT底物耗尽现象的发现和解决[J].国际检验医学杂志,2011,(14):1623-1624.

[2]李方伟.如何避免将高值丙氨酸转氨酶当低值发放[J].实用医技杂志,2014,(01):60-61.

[3]刘成;刘爱华.生化分析仪检测酶活性过程中底物耗尽的监测和处理[J].检验医学与临床,2011,(04):484-485.

[4]吕荣敏.重度溶血对人血清生化项目检测干扰及消除干扰影响的分析[J].检验医学与临床,2015,(15):2200-2201.

[5]徐爱静.高脂血症对部分生化项目测定结果的影响[J].大家健康(学术版),2015,(03):49-50.

[6]莘琳琳;范雪松;陈柯;袁慧.4种不同方法学对可溶性生长刺激基因2蛋白试剂盒性能的初步评价[J].标记免疫分析与临床,2022,29(05):857-862.

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