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核酸的分离和纯化

mango524 2023-5-2 12:02 PM 390人围观 技术

核酸分离和纯化的目的是以最佳方式将DNA和/或RNA从所有其他细胞和细胞外成分中分离出来并进行纯化。纯化可以去除所有(细胞外)成分和其他干扰物质。

 

后者可能来自于基质和用于分离的生化试剂。一般来说,基质成分会产生负面影响(吸附、抑制和水解),而生化试剂会刺激或抑制测定,如PCR,取决于其浓度。创造一个可以提纯DNA和/或RNA的水环境是非常重要的。

 

一旦细胞的完整性被打破,许多可能干扰PCR结果的因素就会释放到溶液中。尽管粗制的分离物可以作为PCR的样本,但大多采用纯化步骤。这尤其涉及到容易迅速分解的mRNA。

图1 | DNA分离方案的七个例子

每个方案都从原始的核酸样品开始,最后得到或多或少纯化的核酸溶液。不同的程序可以结合起来,并可能导致最终的核酸溶液的纯度提高。


几乎所有取代苯酚-氯仿-异戊醇提取的方法的关键步骤是使用Boom法,通过这种方法,核酸被存在于磁珠或滤膜上的硅酸盐颗粒捕获(图2a, b)。

图2 | Boom法:使用硅酸骨架和硅藻进行DNA的硅酸盐和亲和色谱法

硅酸盐为核酸在过滤器、柱子和磁拍上的固定化提供了一个通用的基质。钠离子和核酸的磷酸盐基团(DNA和RNA)之间将发生离子结合反应,水和混沌盐的存在。现在,污染物可以用离心法洗净。纯化后的核酸可以再次解离。

(a)硅藻的外部骨架的例子。来自骨架的硅酸盐的极其有利的表面-体积比实现了核酸和载体之间的最大相互作用。

(b)对核酸和硅酸盐在混沌盐存在下的相互作用的化学解释。

 

某些盐类,如LiCl和异硫氰酸胍(GuSCN),在水环境中选择性地使蛋白质变性。DN酶和RN酶也会变性,从而被GuSCN灭活。因此,蛋白质可以从高分子核酸中被去除,而高分子核酸则留在溶液中。离心法也可用于分离相关的馏分,例如去除红细胞和/或白细胞。

 

为了从植物材料中分离出高质量的DNA,这种DNA需要从高分子蛋白质/结合物(来自细胞壁/木纤维)和淀粉中分离出来。由于这些材料具有与DNA类似的化学和物理特性,因此出现了分离的问题。

 

新的提取缓冲液中含有更具侵略性的成分(CTAB、N-月桂酰肌氨酸),有助于将DNA选择性地保留在溶液中。大型深冻样品可以用研钵和研杵研磨。如果基于Boom-/Silicate的方法的回收率不足,有专门的方案和方法用于分离核酸。

 

为了获得高质量的mRNA,基于GuSCN和苯酚-氯仿的方法仍然是脂肪和纤维样品的首选方法[1]。然而,困难的基质,如粪便、血液、尿液和固定和/或嵌入石蜡的材料,都需要在实施前用各种方法测试相应的分子技术和样品运输[1-4]。



RNA的分离和纯化



RNA的分离和纯化通常与DNA的分离和纯化相类似。在这两个过程中,细胞的裂解和细胞大分子的溶解是必不可少的。RNA可以通过离心、沉淀或在poly(dT)(真核细胞mRNA)上进行亲和层析从DNA中分离出来(图3)。

图3 | 真核生物mRNA的亲和层析法(poly-A捕获法)

(1)样品悬浮在裂解缓冲液中;核酸(RNA)将在可溶相中。

(2)生物素标记的oligo(dT)20与裂解液混合;poly-A/RNA与oligo (dT) 探针杂交。

(3)将50升混合液加入微孔板(或反应容器)中涂有链霉素的孔中。生物素将以高亲和力与链霉菌素结合(CSA)。

(4)用缓冲液洗三次,与oligo(dT)探针解离。现在样品已准备好进行PCR。

 

用DNase处理可完全去除RNA部分的DNA。由于mRNA被迅速降解(通过破碎或被非常稳定的细胞质和其他RNase(如来自上皮细胞)水解),某些预防措施是分离足够的代表性mRNA的先决条件。

 

rRNA比mRNA更稳定,因为它与蛋白质相关。一旦rRNA游离在溶液中,它就会像mRNA一样,暴露在各种RNases中。这些RNases可以在手上、溶液中、空气中、玻璃器皿上和实验室设备上找到。工作程序(如不含RNases的工作)旨在灭活细胞中的RNases并防止含RNA的材料接触「外部世界」。

 

因此,所有的溶液和玻璃器皿都经过高压灭菌处理,或买来不含RNases。在工作中,要戴上手套和/或使用RNase抑制剂。有各种化学品可供选择,每一种都有其特定的功能(DEPC、RNasin、RNA later)。含有甲酰胺的介质,如RNA later,可以防止RNA降解,用它可以取得良好的效果,特别是在处理组织时。

 

在分离RNA时,可以分离ERM RNA或Total RNA。大约需要106个哺乳动物细胞才能分离出1毫克的总RNA。即使是低表达量的mRNA也能得到足够数量的回收。

 

真核生物mRNA可以通过聚(dA)尾部与磁珠或含有聚(dT)的膜杂交从粗提物中分离出来。洗去所有其他物质后,用不含RNase的水将mRNA部分与oligo(dT)解离(图3)。



Boom法



Boom在1990年开发了一种方法,利用二氧化硅颗粒手工分离核酸,该颗粒与核酸的磷酸基团形成可逆的盐桥。通过这种方式,可以从基质中捕获核酸(见图2)。

 

这些二氧化硅颗粒可以被离心分离,并与分离物中的其他成分分开。丢弃上清液后,可以加入洗涤缓冲液来重新悬浮颗粒,然后再次离心。通过一些清洗和离心步骤,硅酸盐/DNA复合物与污染物如蛋白质、脂质和其他(大)分子分离,而不像苯酚-氯仿提取那样使用有毒物质。通过将二氧化硅颗粒与各种载体(例如顺磁珠)耦合,有可能简化和自动完成洗涤步骤,并相对容易地从复杂的溶液中分离出DNA。

 

在洗涤步骤之后,核酸在小体积的低摩尔的缓冲液(含10mM TrisHCl/0.1mM EDTA pH 8.2)中从二氧化硅颗粒中被洗脱出来。纯化的核酸可以被定性并立即用于进一步的步骤。

 

如今,Boom方法被纳入了自动化系统。通过这种方式,许多样品可以以标准化和无污染的方式被分离出来,这对诊断实验室来说是至关重要的。

 

自动化提取设备有许多形状和尺寸,为小量、中等量或非常大量的样品进行了优化,专门处理DNA、总RNA或mRNA。通过确定从加注的模型材料中的回收率,可以确定产量。据报道,各种商业系统在产量、纯度和完整性方面有很大差异。

 

为了保存核酸分离物,可以将洗脱缓冲液蒸发掉,得到易于在室温下保存的固体亲水粉末。在使用前,通常将该粉末溶解在相同体积的无核酸酶的水中。另一种方法是将洗脱液冷冻,储存在-20℃或-80℃。

 

参考文献

[1] Chomczynski P, et al. The single-step method ofRNAisolation by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006;1 (2):581–5.

[2] Hosomi K, et al. Method for preparing DNA from feces in guanidine thiocyanate solution affects. Sci Rep. 2017;7:4339.

[3] Gerasimidis, et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Res Notes. 2016;9:365.

[4] Psifidi A, et al. Comparison of eleven methods for genomic DNA extraction suitable for large-scale whole-genome genotyping and long-term dna banking using blood samples. PLoS One 2015;10(1):e0115960. doi:10.1371.


原作者: IVD工具人
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