重视新型实验室技术 助力菌阴肺结核诊断

基金项目：北京市优秀人才培养资助青年拔尖人才项目（2017000021223ZK39）

作者单位：101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所 首都医科大学附属北京胸科医院

通信作者：逄宇，Email：pangyupound@163.com

结核病仍然是危害人类身体健康的重大公共卫生问题，全球每年新发结核病患者超过1000万例，同时有近170万例患者死于结核病。结核病的早期诊断不仅可以提高患者预后，同时对于有效控制结核病在人际之间的传播具有重要意义。菌阴肺结核是指诊断缺乏痰涂片和培养依据的活动性肺结核。据估算，我国菌阴肺结核患者约占所有肺结核患者的70%。由于菌阴肺结核患者缺乏特异性临床表现，仅依靠医生的临床经验进行诊断易造成误诊、过诊和漏诊，因此，迫切需要快速、准确、价廉的诊断技术为其诊断提供实验室证据。此外，中华人民共和国国务院办公厅颁布的《“十三五”全国结核病防治规划》中明确指出，到2020年，我国肺结核患者病原学阳性率达到50%以上。因此，菌阴肺结核的诊断值得我们进一步关注。

一、努力提升现有结核病实验室诊断的质量

痰涂片和培养仍然是我国现阶段结核病患者发现最主要的实验室检查手段，然而，两种细菌学检查方法受到诸多因素的影响。研究表明，细菌学检查的影响因素之一就是痰标本质量，唾液痰中结核分枝杆菌阳性检出率明显低于其他类型的痰标本；同样，实验室质量控制存在问题将在细菌学检查中容易造成假阴性的发生，其影响因素有试剂质量、操作规范程度等。因此，需要首先甄别菌阴肺结核患者中部分由标本质量等因素造成的“假阴性”。应重点关注标本质量和操作规范，加强与临床人员的沟通，强化标本质量在检测效果中重要意义的认识；同时，努力提升结核病实验室检测质量，从而提高结核病患者病原学检测的阳性率。

二、合理应用现有的菌阴肺结核诊断的适宜技术

当细菌学检测方法对于痰标本“束手无策”时，分子生物学技术、免疫学技术和病理学技术可为结核病实验室诊断提供重要补充。然而，如何理解并合理应用现有的菌阴肺结核诊断的适宜技术，并且服务于临床一直存在争议。

（一）综合运用菌阴肺结核诊断的分子生物学技术

近年来，随着分子生物学技术发展的突飞猛进，涌现出一批用于结核病早期诊断的快速诊断技术。多中心大样本临床评估结果表明，多种分子生物学检测技术不仅对菌阳肺结核患者具有很高的检出率，而且对于菌阴肺结核患者也具有一定的阳性检出率。上述研究成果拓展了分子生物学检测技术用于菌阴肺结核诊断的应用前景，特别是2013年世界卫生组织修订了结核病的诊断标准，将世界卫生组织推荐的分子生物学检测技术阳性检出结果视同于细菌学检测阳性，作为病原学阳性结核病的诊断依据。我国也于2017年修订了肺结核诊断标准，将分子生物学技术检测阳性结果作为病原学阳性结核病的诊断标准，从而极大地补充了传统细菌学检测方法，积极发挥分子生物学检测技术对于涂阴肺结核患者的诊断优势，从而使其更好地服务于临床。

（二）正视免疫学技术在菌阴肺结核诊断中的作用

结核病免疫学诊断技术主要包括血清结核抗体检测、结核变态反应原皮肤试验和结核特异性抗原γ干扰素体外检测，三者均可辅助诊断结核病，特别是对于菌阴肺结核的诊断，上述3种免疫学方法均表现出了特有的优势。其中，血清学抗体检测技术近年来由于其高度可变的敏感度和特异度，一直饱受诟病。近期撰写的关于结核抗体检测的专家共识中系统分析了导致上述问题的原因，提出在提高产品自身质量的同时，优化检测平台，筛选能够反映不同患者感染发病状态的抗原组合，将是未来发展的方向。第二，结核变态反应原皮肤试验，即结核菌素试验。一个世纪以来，结核菌素试验一直广泛用于结核病流行病学调查和监测，评价卡介苗接种质量及辅助结核病的诊断和鉴别诊断。但是由于其不能区分卡介苗接种与结核感染，因此，其检测特异度受到很大影响。近期出现的人型结核菌素试验，能够排除上述混杂，尤其在菌阴肺结核患者的辅助诊断中可以提高检测特异度，未来具有一定的应用前景。第三，结核特异性抗原γ干扰素体外检测试验是目前国内外最主流的用于结核感染检测的方法，特别是对于特殊人群，其可表现出很高的阳性率。因此，可以为菌阴肺结核的辅助诊断提供重要依据。两项在人群中开展的研究表明，γ干扰素体外检测结果受结核病诊断依据、痰菌量、既往结核病史或肺部陈旧性结核病灶、非结核分枝杆菌（NTM）感染、结核病灶部位等多种因素的影响，因此，在将其用于辅助诊断菌阴肺结核时，需综合考虑上述各项因素后做出判断。值得注意的是，在实际工作中，不可忽视免疫学检测方法的作用，更不能夸大其在结核病诊断中的作用。

（三）拓展病理学在结核病诊断中的作用

病理学诊断是细菌学之外最重要的结核病确诊途径之一，在痰菌阴性的肺结核及肺外结核的诊断中发挥着非常重要的作用。传统的肺结核病理学诊断主要采用抗酸染色及苏木素-伊红染色等。抗酸染色是寻找病原学依据的重要途径，但其敏感度较低，在临床诊断中通常结合“肉芽肿性炎症”这一重要组织病理学特征。但是由于其他感染亦可能出现上述特征，因此，联合其他结核特异性的检测方法，对于提高病理学诊断菌阴肺结核的特异度具有重要意义。本期董宇杰等评价免疫组织化学及荧光定量PCR对结核病的诊断价值，与传统抗酸染色法相比，其敏感度从27.1%分别提高到52.1%和60.4%，提示免疫学及分子生物学检测方法可为结核病的诊断提供更加敏感和准确的依据。但是，病理学有创检查的特点可能限制了其在菌阴肺结核诊断中的作用。

三、展望

尽管众多新型诊断技术为临床诊断菌阴肺结核提供了备选方案，但是菌阴肺结核实验室诊断技术的效能仍然差强人意。并非是现有技术的敏感度不够高，而是由于肺结核发病机制的复杂性所致。痰标本中含有的结核分枝杆菌菌量依赖于结核病灶进展，并与引流支气管相通，此时需要患者的病情进展到一定程度，而当患者在发病早期阶段就诊时，通常病灶中结核分枝杆菌并未进入气管。因此，使用传统的细菌学及分子生物学方法注定无法圆满完成对这种早期菌阴肺结核患者的诊断。2009年，有研究报道采用检测尿液中的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）诊断结核病。LAM是一种结核分枝杆菌细胞壁成分，活跃代谢的结核分枝杆菌会合成大量的LAM并从细胞壁到血液，并部分进入尿液中。然而前期的评估结果表明，基于LAM的抗原检测方法在HIV阳性的结核病患者中的敏感度达到67%，而在HIV阴性的结核病患者中的敏感度仅为14%。提示基于尿液的LAM检测方法仅适于HIV感染的特殊人群。2017年，美国科学家报道了一种基于对结核分枝杆菌分泌蛋白（培养滤液蛋白10和早期分泌靶抗原6）为标志物的抗原检测方法，借助质谱技术可以从结核病患者血液中通过早期发现活跃代谢的结核分枝杆菌分泌的蛋白肽段，从而对菌阴肺结核患者进行诊断。尽管上述新技术尚处于研发及上市审批阶段，但是上述方法为结核病诊断提供了一种新思路，即开发基于结核分枝杆菌分泌抗原的新型诊断技术是未来诊断菌阴肺结核的重要方向之一。

此外，除了分泌抗原的检测方法，寻找血液中新型诊断标志物也是结核病特别是菌阴肺结核诊断的新思路。近年来，基于外泌体发现的非编码RNA被广泛应用于肿瘤、精神类疾病的早期诊断。外泌体中丰富的非编码RNA使其检测成为一种有巨大潜在价值的无创诊断方法。目前，对结核病外泌体的研究正处于早期阶段，随着对结核病患者血液转录组及代谢组学的不断解析，未来将发现越来越多的适用于结核病早期诊断的标志物。

加强菌阴肺结核的早期诊断，对于有效控制我国结核病疫情具有重要意义。努力提升现有实验室诊断质量、综合运用现有实验室诊断技术将提高菌阴肺结核诊断的准确性。但是，鉴于结核病的发病机制，在血液中寻找适合结核病早期诊断的新型分子标志物及检测平台将从根本上弥补现有实验室方法对于菌阴肺结核诊断的不足。