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新冠核酸检测无内参?这 9 大原因一分析就明白

归去来兮 2022-12-1 3001人围观 杂谈

大家在做新冠核酸检测的时候经常会碰到一个问题:某个反应孔的内参没有曲线,甚至整板的内参都不起,往往这时大家第一个想到的就是标本不合格,需要重新采样,其实不然,内参基因无扩增曲线的原因有很多,需要具体情况具体分析。


图 1

图源:作者拍摄

首先,我们先要搞明白什么是内参?新冠核酸检测中的内参分为两种,一种是内源性内参,另一种是外源性内参。


内源性内参其实就是人体组织和细胞中表达比较恒定的管家基因,常用的管家基因包括 GAPDH、BETA-actin、18sRNA、B2M、HPRT 和 TBP 等。内源性内参可以监测标本的采集、检测、扩增等各个环节。因此,内源性内参的应用比较广泛。


外源性内参,是一种人工设计合成的与模板扩增效率相似的基因片段,需要额外加到提取溶液中,外源性内参由于是人工设计的基因片段,其扩增效率与靶基因相近,因此能够更好地反应核酸提取及扩增的过程。


在搞清楚上述两个概念之后,我们再来分析一下新冠核酸检测中无内参的原因:



01

标本采集的原因

❶ 标本采集不合格可能会导致内参基因无扩增曲线,原因在于未采集到足够的细胞,核酸提取后内参基因片段极少,导致内参基因无法正常扩增。


但是,当下应检尽检、愿检尽检所使用的采样管通常是 10 合 1 或 20 合 1 的采样管,这种情况下,因标本采集不合格引起内源性内标无扩增曲线的情况极为少见。


 应当注意的是,当样本的内源性内参基因的扩增曲线 Ct 值偏大,或者曲线较早地进入平台期时,都要引起注意。前者可能是由于采集的样本中细胞较少造成的,后者提示样本中可能存在抑制物,抑制 PCR 的反应。


图 2

图源:作者拍摄

在这需要说明的是外源性内参只参与提取和扩增的过程,不能检测标本的采集,这也是外源性内参的一大缺点。



02

核酸提取的原因

由于现在要求核酸检测结果要及时发布,很多厂家不仅缩短了核酸的扩增时间,提取的程序也大大缩短,通常磁珠法提取在 30 ~ 40 分钟,目前很多厂家都能做到 10 ~ 20 分钟,但是,更快的提取速度,并不能保证提取的质量。


笔者曾在试验中发现,使用某种更快的磁珠法提取程序,会导致部分样本的内参基因无扩增曲线,对比两种不同时间的程序发现,更快的提取程序,磁珠与样本的孵育时间缩短,推测可能导致样本中的核酸与磁珠结合较少,导致部分样本内参无扩增曲线或扩增曲线 Ct 值偏大。


因此,建议实验室在更换更快的提取程序时,做好性能验证或性能确认试验,以验证该程序是否能在本实验室检测系统中达到国家要求的检测限。



03

扩增试剂的原因

扩增试剂在引起检测结果无内参的原因主要有以下两方面:


❶ 未达到要求的反应体系,PCR 反应体系要求比较严格,我们可以了解一下 PCR 的标准反应体系:例如 100 uL 的 PCR 反应液各成分的浓度要求:① 4 种 dNTP 混合物各 200 umol/L;② 引物各 10 ~ 100 pmol;③模板 DNA 0.1~2 ug;④Taq DNA 聚合酶 2.5 U;⑤Mg2+ 1.5 mmol/L。


可以想象,在 20 ~ 50 uL 的反应体系下,多加 2 uL 或少加 2 uL,反应液中反应物质的浓度会有较大的变化,因此,可能导致反应不能正常进行。


 扩增试剂的长时间高温放置会导致检测结果异常,扩增试剂要求的保存温度通常是 - 15 ℃ 至 - 25 ℃,反复地冻融可能会导致酶的失活或者或者探针的降解,导致反应不能正常进行。另外,同种试剂的不同批号最好不要混合使用。


图 3. 长时间放置,导致反应体系发生变化
图源:作者拍摄



04

人的因素

检验五大要素「人、机、料、法、环」中,人的因素排在第一位,在导致核酸检测内参基因无曲线的原因中,人的因素主要表现在一下几个方面:


❶ 分液不均,这就会导致反应体系发生变化,引起反应物质浓度发生变化,进而造成反应不能正常进行;


 样本未加入提取反应孔,由于大批量的核酸检测和人员的高强度工作,可能导致样本提取过程中,因操作人员一时的疏忽,导致样本加错或未吸到样本溶液而导致扩增的内参基因无扩增曲线;


❸ 上错扩增程序,前面我们已经讲过,不同的扩增试剂选择的内参基因可能不同,因程序的选择错误可能导致整板的反应都没有内参基因的扩增曲线,这无疑会极大地增加工作量。因此,在核酸检测这样高强度的工作中,一定要加强工作人员专业知识培训和实操指导,避免失误。


图 4. 分液不均,导致反应体系发生
图源:作者拍摄



05

内参自身的原因

前面我们已经讲过,内参分为两种:外源性内参和内源性内参。内源性内参可以监测标本的采集质量,而外源性内参则不能。但是,目前开展的新冠核酸检测并不仅限于人的标本,还有大量环境、物表的样本需要检测,而这些样本中是不含人的管家基因的,当使用内源性内参的扩增试剂时,扩增结果肯定没有内参基因的扩增曲线,而选择外源性内参的扩增试剂却能较好地反应试验过程。


图 5

图源:作者拍摄


另外,还应当注意内参基因的「污染」问题,尤其是内源性内参基因的「污染」,当实验室大批量、高强度的检测时,操作人员频繁的开盖加样,导致生物安全柜内存在大量的气溶胶,这些气溶胶飘落到其他的提取反应孔中,引起其他反应孔内参基因扩增曲线的变化,导致内参基因的监测功能「失效」。


因此,在遇到内参基因无扩增曲线的情况时,大家不要慌张,根据以上五点分析原因,就能找到解决问题的办法。


PS,大家还可以点击链接查看(新冠核酸检测内标无扩增的 8 大原因分析!)了解内源性内参无扩增的具体原因~



作者:陈磊 潍坊市第二人民医院检验科 


参考资料:

1. 李金明,张瑞。新型冠状病毒感染临床检测技术。北京:科学出版社.2020.

来自: 丁香园检验时间
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