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【冯仁丰】蛋白质标准化:免疫散射比浊和/或免疫透射比浊检测方法的最佳化 1 ...

归去来兮 2022-11-30 177人围观 技术

\ 蛋白质标准化 /

免疫散射比浊和/或免疫透射比浊检测方法的最佳化

冯仁丰

在上世纪90年代,为了满足临床实验室面对临床对疾病的诊治的需求,专门对多个蛋白质检测,建立了世界上第一个以血清为基础的多个蛋白质的参考物质。这就是CRM 470。制备这个参考物质非常不容易,动员了全世界临床实验室在免疫化学检测上的专家、优秀的体外诊断产品厂商、和各方力量,汇聚在一起终于制备出大家满意的参考物质。但是,如何为该参考物质的各个蛋白质确定定值,这是一个大问题。2001年,当时为欧洲DAKO公司服务的一位免疫化学大师Dr Soren Blirup-Jensen,被邀请专为免疫化学,特别是为免疫散射比浊和免疫透射比浊检测蛋白质,书写一个蛋白质标准化系列共有五篇文章。文章分别是:1、蛋白质纯化。2、确定干燥重量。3、方法最佳化。4、以参考制品向靶物质设定血清蛋白质。5、值的转换。


这五篇文章对临床实验室很有价值。尤其是后面三篇。因此,我将在蛋白质检测系列中逐一进行介绍。


今天向大家介绍的是免疫散射和/或免疫透射比浊方法的标准化。

今天在常规实验室定量蛋白质检测几乎都使用了自动化仪器。但是,在检测原理上、在仪器编程或在实践中的细微差异,会导致不同的结果。因此必须实施方法最佳化和标准化为前提。


本文讨论了免疫透射和散射比浊的基础原理。展现和研究了不同读数原理。证实了各个问题,提出了在相同仪器上形成集成、快速、方便的检测系统,去检测多种不同蛋白质。


免疫透射比浊和免疫散射比浊的最佳检测系统,应组合高质量的抗体、校准品、控制品、和缓冲液,并具有一个详细的参数设定,正确地为仪器编程。


一个好的用户程序可以充分利用不同仪器的最佳读数原理。这意味着-- 对所有合适的仪器 -- 样品预温后进行实际样品空白检测,去自动地校正样品中的初始浊度。同样,推荐检测试剂空白,它代表了因抗体本身引起的浊度。通过这两个空白值纠正了所有信号,使特定分析物得到最好的可能信号。


一个最佳的检测系统应给出一个很宽的检测范围与很宽的安全范围,对用户来说得到了很少的重检和在抗原过剩下的最大安全。


依据六个标准的非线性校准曲线,使用合适的数学拟合模式,得到合适的校准曲线。


引言


定量测定生物体液,如血浆、血清、脑脊液、和尿液内各个人蛋白质,是临床诊断疾病和监视疾病原因,并有效治疗的重要手段。


在20 多年前,作为每天常规的一部分,临床化学实验室需要进行相当数量特定蛋白质检测。使用定量凝胶沉淀技术(如免疫电泳[火箭]、和单向放射免疫扩散[SRI],是可靠的方法。但这些技术很慢(要求数小时到几天得到结果))。另外,它们相对地很费人力和物力,因此很昂贵,不能自动化。在上世纪末和本世纪初,凝胶沉淀技术已经被快速和自动化的最佳检测系统取代,可在液相下抗原和相应抗体间有快速和特定的反应。


临床化学的许多自动化仪器,原先是为了对化学的或酶反应进行比色测定。一旦销售后,它们使用的逻辑延伸,到了为免疫透射比浊进行蛋白质的测定。但是,由于抗原和抗体间的快速反应很快就成为证据,仪器的最佳编程是为得到可靠和可再现结果的重要因素。在对一些基础和非常重要的反应参数进行了研究和建立后,去设计和为最佳测定每个单一的蛋白质就没有太困难了。但是,形成一个集成、快速、方便的检测系统,可在同一仪器上同时测定多种不同蛋白质,不要求相当数量的工作。


由于在现有文献中难以发现理论和实践方面,对以透射比浊和散射比浊蛋白质检测的最佳化内容,有必要研究每一个单一参数,理解自动化仪器上依据免疫透射比浊和免疫散射比浊的免疫化学反应。如果自动化仪器被用在校准品和控制品设定值,这个理解和最佳化很重要。一旦某个蛋白质被纯化(1),并使用干重测定建立了浓度(2),必须发现从参考制品向靶物质值的转换的可靠方法。这个要求对纯化蛋白质以及为病人样品是必须的。在二者情况下,方法应可将每个单一蛋白质浓度转换到某个可检测的信号。但是,即使在检测程序中、仪器编程、和在试剂中的细微差异,会导致不同的结果(3)。这必须是方法最佳化和标准化的前提。


一些理论和实践的考虑在以下讨论,为了理解和消除这些因素的影响。最后得到的结果是一个精确的转换方案,和为每个蛋白质使用最佳的详细参数设定,使用最佳试剂上专用的自动化仪器。这样的方案被形成和在批准国际参考制品“有证参考物质CRM 470”上进行的值设定练习上得到确认(4)


透射比浊和散射比浊的基础原理


a)抗原与抗体的反应

当一个溶解的抗原与合适比例的相应抗体混合时,形成沉淀。这个反应于1935年被Heidelberger和Kendall领先研究中以定量词语叙述了这个反应(5)。在现在的经典实验中,它们显示了,当增加抗原量,添加到系列含有相应抗体的检测管中,分析沉淀量,得到了图1的沉淀曲线。

图1、定量免疫沉淀曲线(Heidelberger & Kendall)或剂量响应曲线。Ab:抗体;Ag:抗原。

 

这个曲线可分为三个区带:

1)抗原过剩区

   沉淀量随着更多抗原加入而增加,但上清液里依然含有游离抗体。


2)平衡区

   发生了最多的沉淀,上清液既无游离抗原也无游离抗体。


3)抗原过剩区

   因高抗原的浓度,形成小的、可溶性免疫复合物,而不是真正的沉淀。上清液含有游离抗原。


  这个定量的免疫沉淀曲线形成了免疫沉淀检测所有类型的基础,包括免疫透射比浊、免疫散射比浊,经常也被称为剂量-响应曲线。在实施透射比浊或散射比浊的蛋白质测定中,很重要地要知道反应处在曲线的哪个部分,由于一个相同的读数会相应地有两个不同的抗原浓度。检验中,总是将所有测定置于曲线的左侧,即,抗体过剩区。


  与凝胶沉淀技术相反,如SRI和火箭免疫电泳,一个过量抗原移向含有抗体的凝胶。移动一直继续,直至抗原-抗体复合物已经达到某个大小,它们不再留在凝胶环境中的溶液里。这些技术所以从曲线的右侧起,即抗原过剩去走向平衡。这解释了,为什么在凝胶沉淀技术得到的结果,不总是与透射比浊或散射比浊的结果一致。


b)检出原理

透射和散射比浊是依据光学检测系统,measures the light emerging from a reaction cuvette. 测量了从反应比色皿出来的光。这个光检测可以被用于估计悬浮在液体中非常小的颗粒的浓度。当稀释的抗原溶液与相应抗体溶液混合时,抗原与抗体间反应结果形成了免疫复合物,溶液变得浑浊。如果光通过该反应比色杯,相对于入射光光轴,被散射到不同角度。选定了某个角度进行检测,即为散射比浊。不同散射仪器上选择角度不同,由于它是复合物的大小、和入射光波长的函数。


比色杯内没有发生反应下,所有入射光直接通过比色杯。但是,如果有反应形成颗粒(即,不溶性免疫复合物),在光透过比色杯时,增加了入射光被散射。同时也减少了透过光。


散射比浊是依据检测散射光强度的原理,透射比浊是依据检测透过光强度的原理。这两个检测原理可见图2。

图2、透射比浊和散射比浊检测原理。a:入射光,b:slit光栅,c:反应杯,d:光检测器,e:光封闭设施。


  由于在透射比浊中透过光代表了减少的信号,正常地使用透过光的负对数,等于吸光度(或光密度)。以吸光度增加的量实现了与抗原浓度的关系。注意,比色杯内免疫化学反应在透射比浊和散射比浊是一样的。仅在检测原理上,要确定仪器实施了透射比浊还是散射比浊。

TO BE CONTINUED

来自: 冯仁丰
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