“超神”级经验分享！知道这6方面，做新冠核酸检测的“焦虑”少一半 ...

归去来兮 2022-9-19 02:50 PM 794人围观科普

作者：侯赋园蔡镓芊

单位：广州市天河区妇幼保健院

一、极弱样本结果判读标准

和复查办法

新冠疫情爆发将近三年，核酸检测一直是新冠确诊的金标准。实验室对扩增试剂盒灵敏度的要求亦越来越高，尤其是高风险标本应采用灵敏度≤500copies/mL的试剂盒进行检测。如何避免假阴性结果仍然是实验室的努力方向。

虽然目前市场上的试剂盒灵敏度均较高，但在实际工作中仍然存在不少的灰区结果。灰区结果如何处理是一个棘手的问题。

第一个问题是灰区结果的阴阳性判定问题。按说明书来判定阴阳是否妥当？

本实验室在实际工作中发现多例集中隔离点入境人员样本微弱起跳，其CT值大于说明书所述的阳性界限值，甚至扩增曲线尾部只有微弱起跳，其荧光值在阈值线以下。三个例子，分别如下图1-3所示。

图1

图2

图3

按说明书标准则均被判定为阴性。但经疾控机构原样复核，其CT值也均为弱阳或单靶标，结果与本实验室一致。此现象说明，如果按说明书标准判定阴阳，将必定导致该部分标本漏检，发出假阴性报告。

虽然第九版疫情防控方案指明，连续两次新冠核酸检测CT≥35（以阳性界限值为40计算）可以出院。但这与核酸筛查实验室判定结果并没有太大关系，依据CT值判断是否具有传染性、是否可以出院、是否解除隔离是有关部门需要决定的事情，至于筛查实验室该报的可疑结果还是应该谨慎对待、严格把关、提高核酸阳性检出率。

第二个问题是灰区结果如何复查？

灰区结果说明该样本检测物浓度较低。其结果可能为真也可能为假。若为假，则污染风险最高，这也是让实验室非常恐慌的事情之一。

一般认为浓度越低，其重复性越差。所以复查时应该设置多个复孔，增加检测数，提高阳性率。

本实验室检测了11例极弱阳的样本，复查时每个样本设置了3个复孔，即共获得33个孔结果。结果显示每例样本复查结果中既有阳性孔又有阴性孔，且33孔中阴性孔比例超过60%。某样本案例如图4-5所示。

图4 该样本初检结果N基因单靶阳性

图5 该样本复查设置4孔重复：3孔阴性，1孔N单靶标阳性

说明通过增加检测次数，可提高检出率。同时，一般地污染产生后其结果多在灰区，复查结果可以为判断是否为污染提供证据。

二、采样质量如何监控？

检验质量分为检验前、检验中、检验后三个阶段。采样质量属于检验前质控阶段。一个合格的样本是检验结果准确的必要条件。采样部位不对、采样量不足均会严重影响检测质量。

第一，单人单采样本的采集质量如何监控?

多数人会想到使用内源性内参试剂盒，这确实没错。目前评判采样是否合格的指标只有内参CT值，虽然即使内参CT值合格也无法证明采集到了正确部位。

关于内参合格与否，笔者有一个疑问：查阅了多个厂家的试剂盒说明书，其内参阳性界限值均较大，远大于一般样本内参平均CT值。例如内参阳性界限值定为40，而一般样本内参CT值平均为28。那该界限值为40是否妥当？实验室是否应该采用说明书标准对样本结果进行判定？

笔者想是否实验室应该自身建立一个内参CT值是否通过的标准，其要求应该比说明书严格得多。经过大样本的检测可以发现，其内参CT值近似于正态分布，可以探索采用平均值加减3倍标准偏差（x±3s）失控规则作为内参通过标准是否合适，亦或者尝试其他规则。对于内参CT值过大的样本，实验室应当震荡充分后继续检测，如果确定采样不及格则应重新采样。

第二，混采样本采集质量如何监控？

混采样本的采集质量评价比单采难度更高，甚至是有点无能为力。

由于混采存在平均效应，因此其内参CT相比单采而言更加集中，即超标的可能性变小，最终认为该混采管内参CT值合格。

但也正是由于平均效应的存在，我们无法判定混采管中是否有人采样失败。因此相对单采而言，混采的采样质量更加无法客观监控。

此外，混采管还有一个洗脱和混匀的问题。经实践发现，混采管震荡不起来，实验室只能上下颠倒。可以想象，其洗脱和混匀程度应该是达不到理想要求的。

三、试剂盒的选择比较

首先应尽量满足说明书推荐的匹配试剂和仪器设备。就某一扩增试剂而言，搭配不同厂家的提取试剂或者仪器，即不同的检测系统组合，其检测效果也不同。

另外，笔者在实际工作中发现一个现象：在多次对比中，两个厂家的扩增试剂在检测室间质评品和临床阳性样本时，其检测效果不一致。如A公司检测室间质评品效果优于B公司，但是B公司检测临床样本时其效果优于A公司。此处可能存在基质效应的问题。因而建议在选择试剂厂家时，应该尽量把临床阳性样本加入至效能对比试验中。

四、污染预防

扩增产物污染

扩增产物含有高浓度的核酸模板，应该避免打开扩增管盖子。

扩增完毕后小心取出，放至密封袋内密封，按医疗垃圾处理。密封袋不宜装太满，不超过四分之三，而且袋内空气尽量排空。

扩增产物不宜高压高温处理，容易产生气溶胶，导致实验室污染。

质控品污染

质控品解冻后，不宜剧烈震荡，应柔和颠倒混匀。

混匀后可高速离心5分钟，一是保证不挂壁，二是减少气溶胶。

质控品不宜放置于试剂配制区。试剂盒内的厂家阳性对照使用密封袋密封，不宜丢弃于试剂配制区，以免发生意外泄露造成试剂配制区污染。

样本交叉污染

采样人员应及时盖紧盖子，减少漏液。检测前，可使用2000mg/L有效氯次氯酸钠溶液喷洒样本管外壁。检测中，及时处理漏液和溢洒。

除以上之外，污染预防还应该保持实验室空气与外界空气交换，及时清洁实验室仪器设备、操作台面、地面等均非常重要。必要时可以适当扩大次氯酸钠溶液的使用范围，因其可氧化损伤核酸，可有效地清除污染，且价格便宜。酒精并无杀灭、破坏核酸结构的功能，因而其对污染的清除效果有限。

五、污染处理

污染形式一般分两种，一是气溶胶污染，一般较难发生，一旦发生则最难清除；二是接触性污染，在实验室较为常见。

污染的判定

危害性最大的是新冠病毒靶标基因存在污染。气溶胶污染发生时，一般会出现多孔阳性，甚至整板全军覆没，CT值均差不多。

接触性污染时，一般也会出现多孔阳性，可能数量少于气溶胶污染，但不是绝对。其阳性孔间CT值也差不多，多在35之后。接触性污染通常有点规律，例如试剂分装前试剂被污染，那么绝大部分孔均会阳性起跳，扩增曲线较为一致，现象类似于气溶胶污染。如果是手套有污染物，则可能在解除扩增管盖子时污染盖子，污染多发生在管盖上手套接触过的部位，一般是在八连管的两端出现污染较多。如果移液枪有污染，则其阳性孔分散度较高些。

污染状况摸底

一般筛查实验室阳性率极低，发现多孔阳性后首先应怀疑是否存在污染。此时应该启动污染处理应急程序。首先应当摸清污染程度和状况，一股脑地大范围无差别地做清洁，本人以为并不妥当。应当先摸清是扩增产物污染还是质控品污染，还是交叉污染等。

可以先在不同区域多个位置采集物表样本以及空气样本，提取后采样带内源性内参的新冠扩增试剂盒检测。采集的位置应尽量多，以便跟踪污染物分布状况。检出阳性的位置则代表该处有污染，CT值最小的地方极可能是污染的源头。例如，若发生扩增产物污染，则一般扩增区污染物浓度最高，其他房间浓度比较低。如果在标本制备区质控品发生污染，则标本制备区某些部位污染物浓度较高，其他房间浓度低些。根据污染物传播路线，越往后走，其浓度一般是越低的，即其CT值呈现越来越高的趋势。

污染清除和效果监控

摸清污染传播路线和浓度分布状况后，污染清除工作相对会比较有的放矢，实现重点部位重点打击。

气溶胶污染相对难清除，污染无缝不入。最好的办法是加强室内外空气交换、重复净化空气、清洁物表、监控效果等步骤，直至污染消失。需注意的是若一次性把各区的窗户门都打开，可能会引起其他干净的房间被污染。

解除性污染则主要应清除物体表面的污染物，污染通常存在于工作人员经常接触的物体表面，采样时主要采集该类位置，清洁时也应优先处理该位置。

清洁方法

可以使用2000mg/L有效氯的次氯酸钠溶液擦拭、擦洗物体表面，但要注意精密仪器、金属设备的保护。能冲洗的直接水龙头冲洗，能擦的则次氯酸擦拭（及拖地面），只能喷的就次氯酸喷（如空气）。次氯酸作用30min后，使用清水再清洁一遍。

之后打开紫外线照射物表及空气，紫外线照射的最佳效果为60-90cm范围内。（破坏污染物，次氯酸效果强于紫外线，紫外线作用有限。酒精不能破坏核酸结构，清除污染的效果更差）。完成一轮清除活动后，采集环境样本检测。如此循环，直至没有阳性起跳。

六、关于两点问题的讨论

新冠核酸检测中是否一定需要设置三个阴性对照？一定需要随机？

可以肯定的是，阴性对照的设置意义本身在于监控实验过程是否有污染。但是在大规模筛查时，其阳性率极低的情况下，每个阴性样本都可以被当做阴性对照，设置多个阴性对照略显浪费。

同时在实际工作中，每板样本汇中多个阴性对照随机放置将增加工作人员的劳动量、增加出错率。如此讲，从监控阳性污染的角度出发，该阴性对照的设置似乎是多余的。但是从监控内参污染的角度考虑，该质控规则确有意义。因其可以看出实验是否存在内参污染，若有则说明实验过程中操作不够细致、不够小心，遇到阳性样本时极可能造成污染。

新冠病毒核酸质控品序列全长设置的利弊

相比假阴性结果而言，似乎假阳性结果的社会危害性更小些。导致假阳性结果的原因主要来源于污染，假阳性结果将会造成不必要的恐慌与防控资源浪费。

由于我国新冠病毒阳性率低，因此多数实验室所能接触到的阳性样本极其有限，甚至许多实验室尚未遇到过阳性样本，但污染却时有发生，且一旦发生严重污染，所有厂家的试剂均可以检测出假阳性。

届时首先是污染真假难辨，然后是实验室可能必须停工做清洁。究其原因，污染的产生主要由于质控品的不当使用而引起。对于此，除了做好操作人员培训、提高操作严谨性外，我们似乎没有更好的办法了。

也许还可以从质控品本身因素考虑。例如质控品不要使用病毒全长序列，某个厂家试剂只对应病毒基因序列的某特定片段。因为不同厂家试剂设计的引物位置不同，由此达到该质控品并非所有厂家试剂均可检测得出的效果。如此，当发生污染时，换个厂家试剂复查，如果结果为阴性，则判断其为污染的可能性非常大。

同时，发生非全长序列质控品严重污染时，更换不同厂家试剂后，实验室仍然可以继续运行，此处应当为病毒基因序列全长质控品的弊端。但在实际工作中，该方式可能也有诸多困难，例如没有统一序列的质控品，不利于室间质评活动的开展，对实验室的检出能力较难监控。此外，生产及质量标准亦难统一。

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来源: 检验医学网

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