干货！ 一文读懂支原体污染检测

支原体( Mycoplasma)属于柔膜体纲，是介于细菌和病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞微生物，他们是已知最小的自我复制的原核生物。支原体细胞大小和形态存在差异，大小介于细菌和病毒之间，能够透过一般滤膜（0.22 μm），呈高度多形性，有球形、杆状、丝状、分枝状等多种不能被革兰氏染色，但可在琼脂固体平板上形成“菌落”且可被甲基蓝染色。支原体以寄生和共生方式存活，部分可能导致动物、植物宿主的病变。对人致病的支原体主要有肺炎支原体、溶脲脲原体、人型支原体、生殖器支原体等。支原体是细胞污染物中比较常见的一种，细胞受支原体污染程度较轻时，不会表现出明显的症状，但一旦这种潜伏的污染暴发时，细胞会大量脱落，细胞培养液会变浑浊。原代细胞和传代细胞都可能遭受支原体污染，根据国外不同实验室的调查结果显示，有15%-80%的细胞被支原体污染，传代细胞的污染率高于原代细胞。

尽管自然界中存在的支原体有120 多种，但污染细胞的支原体主要有5种，分别为牛源的莱氏无胆甾原体和精氨酸支原体，人源的口腔支原体和发酵支原体，猪源的猪鼻支原体，这5 种支原体占所有支原体污染的95%以上。

支原体污染可能来自操作人员和细胞培养用原材料如血清和胰蛋白酶，也可能来自于本身已被污染的细胞系和毒种。细胞受支原体污染后，功能和活性都会受到影响，会带来不可靠的实验结果和不安全的细胞制品，因此对细胞进行支原体检测十分关键。

• 检测样本直接接种到琼脂平板以及液体培养基中。 

• 所选择的琼脂和液体培养基具有令人满意的营养特性，可支持多种支原体的生长。 

• 每个支原体检测分析中都包含阴性和阳性对照，以检查系统适用性。

• 在培养期间，液体培养物在多个时间点被传代培养到琼脂平板上，以观察支原体的生长。 

• 在培养期结束时，用显微镜检查琼脂平板上是否存在支原体菌落。 

• 总检测时间为 28 天。

有些挑剔的支原体菌株被称为“不可培养”，因为它们不能在用于培养方法的标准培养基中生长。Vero 或 NIH3T3 细胞的培养物用于培养支原体。孵育一周后，将细胞固定，用 DNA 结合荧光染料染色，并在显微镜下进行评估。 

在支原体感染的情况下，当污染严重时，细胞表面和周围区域会出现明亮荧光的特征模式。

•特异性核酸扩增及荧光探针技术：这种支原体检测分析检测特定核酸序列的存在，但不一定表明存在活支原体。

•肉汤培养基生长富集和 RT-PCR：这种测定包括核酸检测前的生长富集步骤，以从非活菌和残留环境源中区分活菌。样本在第 0 天和第 7 天进行检测。

•细胞共培养生长富集和 RT-PCR：这种支原体检测方法包括核酸检测前的生长富集步骤，以从非活菌和残留环境源中区分活菌。样本在第 0 天和第 5 天从细胞共培养中进行检测。

•螺原体检测：这种测定包括核酸检测前的生长富集步骤，以从非活菌和残留环境源中区分活菌。样本在第 0 天和第 7 天进行检测。

尽管 PCR 检测更常用于支原体检测，但监管机构并未普遍批准基于 PCR 的支原体检测。可以使用 PCR 作为过程控制和产品特定验证的补充方法；但是，需要对传统方法进行可比性研究，以证明这些方法是等效的。 PCR法检测时间相对较短、广谱性强。虽然PCR法检测快速灵敏，但是，也有一些研究指出，PCR方法也存在可能的问题：（1）支原体的特异性引物与衣原体具有同源性，会使PCR检测结果出现假阳性。（2）细胞培养几天后，培养液中会产生严重抑制PCR扩增的代谢物，所以样品前处理是PCR法不可或缺的一个环节。（3）灵敏度有限，通常需要将培养液离心浓缩或者提取DNA后检测。