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检验医学与蛋白质组学(二)蛋白质组学中应用的主要技术

笔者苏洛 2018-12-11 04:25 PM 1739人围观 技术

      作者:黄山

      单位:贵州省临床检验中心


       目前,蛋白质组的研究大致可分为三个主要步骤:①应用双向凝胶电泳技术(2-DE)、毛细管等电聚焦-串联质谱(CIEF-MS)技术、等电聚集-排阻色谱-质谱(PIEF-SEC-MS)技术等分离蛋白质;②应用氨基酸组成分析、C-末端或N-末端氨基酸序列分析及质谱分析鉴定所分离的蛋白质;③应用生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析。因此,双向电泳技术、质谱技术以及计算机图像分析与大规模数据处理技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。

一、双向凝胶电泳技术

      双向凝胶电泳(2-DE)技术又称二维凝胶电泳技术,是由O′Farrell于1975年建立的一种用于混合的蛋白质组分分析技术,是目前常用的惟一一种能够连续地在一块胶上分离数千种蛋白质的方法,广泛应用于生物学研究的各个领域,其原理是将高分辨率的等电聚集电泳和SDS-PAGE电泳联合组成双向电泳。

1.双向凝胶电泳的原理

      第一向采用等电聚集(IEF)电泳。蛋白质是由20种不同氨基酸按不同比例通过肽键的连接构成,蛋白质的一些氨基酸侧链在一定的pH值的溶液中是可解离的,从而可带有一定的电荷。蛋白质所带的静电荷(构成蛋白质的所有氨基酸残基所带正负电荷的总和),在低pH值条件下,静电荷为正;而在高pH 值条件下,其静电荷为负。若在某一pH值的溶液中,蛋白质的静电荷为0,则此pH值被称为该蛋白质的等电点(pI),等电点取决于其氨基酸组成。当把蛋白质加入到含有pH梯度的载体时,如果蛋白质所在位置的pH值与其等电点不同,则该蛋白质会带一定量的正电荷或负电荷,在外加强电场的作用下,蛋白分子就会分别向正极或负极泳动,直到pH 值与其等电点相等的位置,蛋白质不再泳动,而浓缩成狭窄的区带。等电聚焦电泳就是依照该原理,根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的pI的不同,将蛋白质进行分离。第二项采用了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。蛋白质的电泳迁移率取决于各种蛋白质所带的静电荷、分子量的大小以及形状的不同。十二烷基硫酸钠(SDS),是一种阴离子去污剂,可以断裂分子内和分子间的氢键,使蛋白质分子去折叠,从而破坏其分子的二级和三级结构。巯基乙醇和二硫苏糖(DTT)等强还原剂,则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在蛋白质样品和凝胶中加入SDS和强还原剂后,蛋白质分子被解聚成多肽链,与SDS结合成SDS-蛋白质复合物,而且由于SDS上带有的大量负电荷远远的超过了天然的蛋白质分子原有的电荷,因而消除了不同种类的蛋白质分子间原有的电荷差异,又因为形成的复合物在水溶液中的形状呈椭圆棒状,进一步消除了蛋白质形状对其电泳迁移率的影响。SDS-PAGE就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。蛋白质样品经过双向凝胶电泳两次分离后,其结果不再是条带状,而是呈现为斑点状,在一个方向上是按照pI的大小排列,在与之垂直的另一个方向是按照分子量的大小排列


2.双向凝胶电泳的发展

       O′Farrell最初利用双向凝胶电泳技术对大肠埃希菌(E.coli)的蛋白抽提物进行分析,并采用了放射性核素标记法,借助了放射显影技术,得到1100蛋白斑点,远优于单向凝胶电泳,但是实际分离得到的蛋白斑点数值少于理论分析值,他认为其原因可能有:① 高丰度的蛋白可能覆盖低丰度的蛋白质;②曝光时间过长引起的放射扩散;③E.coli中的全部蛋白质可能没有被全部抽提出。

      随后几年,双向凝胶电泳虽不断改进和提高,O′Farrell还建立了一种非平衡pH 梯度电泳(NEPHGE),在快速形成的pH 梯度中根据蛋白质移动能力进行分离,主要用于分离碱性蛋白质,电泳展开时间相对比较短。但是由于早期的第一向等电聚焦电泳采用载体两性电解质“ampholine”在外加电场下形成pH梯度,这种系统称为ISO-DALT系统,而这样的pH 梯度还不够稳定,所以重复性较差,另外,上样量也少,致使该技术在当时并没有引起人们广泛的重视。

     1982年,固相pH 梯度等电聚集(IPGIEF)应用于双向凝胶电泳,基本上克服了ISO-DALT 的主要缺点,解决了重复性的问题,对其分辨率的提高具有里程碑意义,可以分离等电点仅有0.001pH 单位差别的蛋白质。与传统两性电解质载体在电场作用下形成pH 梯度不同,IPG由丙烯酰胺衍生物与聚丙烯酰胺共价聚合而成固相pH 凝胶梯度,这种系统称为IPG-DALT系统,该系统pH 梯度稳定,不依赖于外加电场,聚集准确,消除了传统IEF阴极漂移及碱性蛋白质丢失的问题,显著提高双向凝胶电泳结果的重复性。Corbett分析双向凝胶电泳蛋白斑点结果重复性发现,室间比较180mm 胶上蛋白斑点的位置平均标准差仅为1mm。另外,应用IPG胶条,样品蛋白质的点样量也远高于传统的IEF,有利于低丰度蛋白质的分离检出,简化了双向凝胶电泳操作,之后对双向凝胶电泳技术的改进和优化主要也集中在IPG胶条的pH 梯度范围及长度上。不同pH梯度范围的IPG胶条用于分离不同的样品:宽幅pH 梯度胶条主要用于简单物种蛋白质组分析,窄幅和超窄幅主要适于复杂蛋白质组的分析,而超窄幅pH 梯度胶条能较好的分离蛋白质及共同种型,亦可减少pI相近的共同迁移蛋白质数量。


3.双向凝胶电泳的相关技术

     (1)蛋白质样品的制备:蛋白质组研究的研究对象包括各种组织和细胞,如何提纯细胞和能否将细胞和组织中所有的蛋白质成分尽可能完全抽提出来,包括跨膜疏水蛋白,极高和极低pI蛋白质,低丰度蛋白质等各种特殊蛋白质,一直是双向凝胶电泳标本预处理研究的热点和难点。由于细胞和组织中蛋白质的复杂性和蛋白质性质的非均一性,致使很难用单一抽提液和方法将不同的蛋白质完全制备出来。蛋白质溶解的效果依赖于选择的细胞破碎方法、蛋白质解聚方法、去污剂和裂解液的调配方法等。

       最近的一些研究对预处理方法进行了一定的改进,如在等电聚焦之前加入硫脲、sulfobe-taine和TBP,可以产生一个高效的IEF样品裂解液,可以溶解一些采用传统的方法无法溶解的蛋白质,也有学者发现用SDS,十二烷基硫酸锂,盐酸胍可以检出部分跨膜疏水蛋白。然而,虽然这些改进方法增强了蛋白质的溶解性,使更多的蛋白质被提取出来,但是同时带来了分辨率降低的缺陷,致使复杂样品的分离结果出现了许多重叠的蛋白质点。为了解决这些问题,有些学者提出了将逐级抽提和高效裂解缓冲液联合起来的方法,比较好地解决特殊蛋白质的提取及分离,该法根据不同组分的蛋白溶解度的差异,首先将含量高的高溶蛋白质去除,降低样本蛋白质的复杂性,从而使许多常规方法下未出现的蛋白出现。该方法实际上是在双向凝胶电泳根据蛋白质等电点和分子量的不同进行二维分离的基础上,增加了针对蛋白质溶解性能的不同的第三维分离。

       其他的改进方法还有:亚细胞分级法和激光捕获显微切割(LCM)等,通过前者可对特定的一组蛋白质进行分离纯化,减少了蛋白质的分散性和复杂性,并预先选择了一类生物学相关的蛋白质,通过后者可以得到较单纯的细胞,消除样本细胞的多样性给实验结果带来的影响。

    (2)蛋白质的染色:不同的蛋白质染色方法灵敏度不同,造成的图谱也不相同,染色的方法选择,是双向凝胶电泳分离的蛋白质能否完全被显示,从而获得理想双向凝胶电泳结果的关键环节之一。传统的蛋白质点的染色方法有考马亮蓝染、胶体亮蓝染、铜染、银染、印度墨染等,目前一些实验室也采用其他的显示检测方法,如放射性核素标记法、荧光标记法、抗体标记法等。这些标记物通过共价键或非共价键与蛋白质或胶中的微环境结合以使蛋白质与基质背景区别显示,其结合过程可以发生在双向凝胶电泳蛋白分离的四个时期的某一时期:IEF前、IEF和SDS-PAGE间、SDS-PAGE后以及分离蛋白转移到膜上后。选择各个不同的时期标记,有其各自的优缺点。选用IEF前阶段标记,可除去一些未反应的标记物,但IEF是在强变性状态下运行,因此,仅共价键结合的标记物可应用于这一时期,不过共价结合的标记物容易改变待检蛋白质的电荷状态,故标记物多为呈电中性的荧光物质或放射性核素,且反应条件比较苛刻。IEF和SDS-PAGE间的标记,标记物只需要保证蛋白质的分子量不变,而不用担心电荷改变,该过程的主要问题是IEF后多余的两性电解质结合大量的标记物,从而影响显示结果,通常采用强酸冲洗固定后的部分。SDS-PAGE后的显示标记大多采用非共价键作用,其可逆性的结合适宜于下游的分析及测序。银染是复杂蛋白显示的常用方法,可检出ng级的蛋白质,蛋白质分辨率高,该法高灵敏的原因在于蛋白质与银离子的高亲和性。但是银染法操作繁琐,动态线性关系不明显,一些条带的可重复性差,动力学范围较小,而且常常造成蛋白质末端封闭,对以后的质谱测定也有干扰。与此相比,荧光染色采用荧光桔、荧光红等被认为是有前途的染色方法,其操作简便快速,具有较高的重复性,其灵敏度与过剩SDS试剂的去除有关,由于荧光试剂往往会引入电荷造成蛋白质等电点的迁移,因此最佳的标记时间是IEF和SDS-PAGE间。


4.双向凝胶电泳的特点和存在的问题

(1)与其他的蛋白质分离技术相比,双向凝胶电泳技术具有以下的优点。

      ①高灵敏度和高分辨率:双向凝胶电泳的灵敏度比较高,但也取决于不同的染色方法,如银染的方法,其灵敏度可以达到10-15~10-18mol水平。而且,分辨率比较高,一般的2-DE能分辨1000~3000个蛋白质点。其原因是由于通过以电荷和分子量差异为基础的两次分离,使得差别比较小的蛋白质成分如糖蛋白的不同糖型成分得以分辨。该技术对蛋白质的有效分离也是进一步对其进行分析鉴定的基础。

     ②操作相对简便:采用其他的分离方法如 HPLC等,往往需要经过多个步骤多次操作,每一次都会造成样品的损失,而且需要比较先进的仪器设备,双向凝胶电泳可以一次性地将细胞中的蛋白质分离和显示出来,有利于从整体上研究细胞蛋白质的组成和变化情况,设备要求也比较简单。

       ③便于进一步分析处理:双向凝胶电泳可以很好地与分析鉴定方法结合起来,电泳后的样品可以较方便地转移到PVDF膜上进行C-末端或N-末端氨基酸序列分析,或者直接采用蛋白质胶内酶解,然后对其进行质谱分析鉴定。该技术分离后的图谱经扫描输入计算机后可以进行蛋白质的定位,等电点和分子量的测定,图谱上的蛋白质在分析定性后,即可建立蛋白质组数据库。

(2)双向凝胶电泳技术存在的问题

      ①不易分离极酸或极碱、极大(>200kD)或极小(<10kD)的蛋白质,不易检测低拷贝(<1000拷贝)蛋白质或难溶解于SDS的蛋白质(如一些跨膜的疏水性蛋白质)。

      ②SDS和强还原剂对蛋白质的变性作用是不可逆的,所以分离出来的是构成蛋白质的亚基,而非完整的蛋白质。

       ③重复性仍有待于进一步地提高。虽然其蛋白质点相对位置有较好的重复性,但其蛋白质点数最多可相差500多点。有实验发现,通过简化程序可以提高重复性,例如省去浓缩胶,在第二项电泳中使用连续的分离胶等。

       ④目前还不能实现完全自动化处理和同时高通量分离细胞或组织中大量蛋白质,且整个分离过程比较耗时,整个流程包括下游质谱分析约需1个月时间,即使部分步骤经改进自动化,仍需要3~7d。


5.双向凝胶电泳的应用前景

       在过去的20多年,双向凝胶电泳技术不断改进和完善,不管是在样品的制备方法、等电聚焦胶条的改进和商品化、染色方法的改进还是最后图像处理技术的加强方面都有了一个质的飞跃,在蛋白质组学的研究中发挥重要的支撑作用。但是由于该技术对于某些特殊性质的蛋白质还无法分离,甚至造成了某些蛋白质的丢失,另外,重复性方面也还没有达到令人满意的程度,所以许多学者,正在积极地研究并且采用其他的蛋白质分离技术,以求弥补该技术的不足。如一维SDS-PAGE分离-串联质谱技术、二维色谱-串联质谱技术(2D-HPLC-MS-MS)、毛细管等电聚焦-串联质谱(CIEF-MS)技术、等电聚集-排阻色谱-质谱(PIEF-SEC-MS)技术等,但是这些技术的分辨率和重现性还不能和双向凝胶电泳相提并论。因此,由于2-DE是惟一在一块胶上同时分离上千种蛋白质的方法,目前尚无其他技术可以完全取代该技术,而且,相信随着技术的发展,在不久的将来,双向凝胶电泳技术在高通量和自动化方面会有很大的发展。

来源: 赢享分子诊断
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