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后疫情时代,核酸扩增技术还将在这些领域发光发热...

归去来兮 2022-4-2 166人围观 技术

孟欢,王雅杰*

首都医科大学附属北京地坛医院检验科




近年来,核酸扩增检测(nucleic acid amplification testing,NAAT)技术在临床病原体检测领域的应用越来越广泛,相对于传统的培养检测方法,其缩短了检测周期、具有高灵敏度和准确度,已成为病原体检测的有效工具[1]


NAAT技术可分为DNA扩增技术和RNA扩增技术两大类。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)属于DNA扩增技术,RNA实时荧光恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing,SAT)属于RNA扩增技术,是一种以RNA为模板扩增出RNA产物,用RNA探针实时检测的恒温扩增技术,其具有灵敏度高、检测时间短、产物不易发生污染等优点,在临床上已经得到广泛应用。本文将介绍SAT技术原理和在临用上的应用进展。


01
SAT技术原理


SAT技术以RNA为模板,带有T7启动子的一条引物与靶标RNA结合,在莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV)作用下逆转录合成cDNA,形成一条RNA-cDNA双链。在M-MLV酶的RNaseH活性作用下靶标RNA链降解,另外一条引物与cDNA单链结合,在M-MLV酶的DNA聚合酶活性作用下产生一条带有T7启动子的双链cDNA。


随后,在T7RNA聚合酶的作用下,以一条DNA双链为模板可以转录出多个(100~1000)RNA拷贝,这些RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环。同时,扩增体系内带有荧光标记的探针与这些RNA产物特异结合,产生荧光。


该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获,直观反映扩增循环情况,整个扩增过程都在42°C下进行。SAT技术是由RNA到RNA的循环扩增,由于RNA在环境中极易降解,可有效避免扩增产物的污染,另外,恒温扩增不需要繁琐的升降温步骤,易于实现实验仪器的自动化[2]


图1 SAT扩增原理图


02
SAT技术的临床应用


01
生殖道感染领域的临床应用


性传播疾病(sexually transmitted diseases,STDs)是由寄居在女性和男性生殖道的微生物引起的,已严重影响人类健康并引起社会和经济问题[3]


沙眼衣原体(Chlamydozoa trachomatis,CT)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)、解脲脲原体(Ureaplasm urealyticum,UU)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium,MG)是临床上常见的STDs病原体,易引起生殖道的各种炎症和不孕不育等危害[4]


以往以DNA为靶标的PCR检测法是以泌尿生殖道分泌物为标本,因侵入式取样方式,患者的配合度很低。SAT法可以尿液为标本,做到非侵入式取样,减少患者痛苦[5-8]


以检测尿液中的CT为例,用PCR的方法需要离心尿液,得到菌体沉淀后再进行检测,如果尿液中的CT含量较少,其DNA靶标会因为低于PCR检测的灵敏度而无法检测到。但是因CT中的核糖体RNA(rRNA)的含量是DNA的数以千倍,直接裂解尿液可以释放出大量的rRNA,这样裂解液里就含有足够SAT检测的靶标RNA。因此SAT法具有高灵敏度、尿液样本取样方便等优势


Liang等[9]发现,在检测CT、NG和UU时,当泌尿生殖道拭子中提取的病原体载量高于103copies/mL时,PCR法和SAT法的检出率均为100%,而当病原体载量低于103copies/mL时,SAT法的检出率分别为57.14%、46.15%和80%,显著高于PCR法(28.57%、0%、0%),表明SAT法比PCR法有着更高的灵敏度,可作为STD早期诊断的有力工具。


其他多项研究显示,SAT法比培养法和PCR法的灵敏度高,此外还有检测周期短、检测下限低等优势,具有较高的临床实用性[9-13]


另外,童郁等[14]发现,在UU感染的47例新患儿中,口服阿奇霉素治疗7、14、21天后,应用胶体金法、PCR法和SAT法复查,结果SAT法的转阴率显著高于前两者,这与SAT法的检测靶标为RNA,可以避免死菌DNA的干扰,只检测活菌RNA的特点相符。


其他研究[15-18]也共同表明SAT在判断疗效上具有更高的临床应用价值,可有效防止抗生素滥用


经过多年的临床应用,目前RNA扩增技术已被列入《梅毒、淋病和生殖道沙眼衣原体感染诊疗指南》[19]《WHO性传播疾病实验室诊断指南》[20]、《淋病诊断》行业标准WS268-2019[21]《生殖道支原体感染诊治专家共识》[22]《非淋菌性尿道炎病原学诊断专家共识》[23]等多个行业指南和共识


02
呼吸道感染领域的临床应用


呼吸道感染是全球范围内人类发病和死亡的主要原因之一,多数呼吸道感染是由病原体微生物引起的[24]


结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MT)感染引起的呼吸道传染性疾病,全球每天有4000人死于结核病[25]。传统的培养法是诊断结核病的金标准,但是其检验周期长、操作复杂。


大量临床研究[26-34]表明SAT法在结核检测中显著优于痰涂片法、培养法、抗体检测法和一般PCR法,并与Xpert法无显著差异,具有快速、准确、廉价等优点,可辅助肺结核的早期诊断,减少误诊、漏诊的发生


白广红等[35]通过7种实验方法对672例临床结核患者的诊断研究表明,SAT法检测符合率为96.4%,高于RT-PCR(90.1%)、BACTEC MGIT960系统培养法(45.7%)、改良罗氏培养法(32.3%)、浓集涂片法(25.6%)、直接涂片法(17%)和抗体检测法(65.4%)。


另外,胡永领等[36]研究发现在药物治疗1个月时,TB-PCR由于死菌仍然可以检测,所以检测阳性率(31.3%)最高,而SAT法的阳性率为23.3%与培养法(21.3%)无统计学差异,且显著优于涂片法(13.3%),表明SAT与培养法有着更好的一致性。


临床上其他研究也表明[37-40]SAT方法由于对活菌有较高的检测灵敏度,在患者治疗过程中,可辅助临床对治疗效果的快速判断,为治疗方案的调整提供实时的参考依据。RNA活菌检测的特性已写入《肺结核活动性判断规范及临床应用专家共识》[41]和《结核病病原学分子诊断专家共识》[42]并在中国疾控中心《中国结核病防治工作技术指南》[43]中推荐使用


肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia,MP)肺炎是临床上常见的社区获得性肺炎之一,多发于儿童[44,45]。目前,MP的检测方法主要有培养法、血清抗体检测和PCR法。培养法检测周期长、操作复杂、且阳性率低[46]。血清抗体检测由于存在窗口期,因此检测早期患者的灵敏度低[47]。PCR法检测快速、灵敏度高,但其靶标为MP-DNA,不能区分活菌和死菌,且扩增产物易污染,出现假阳性[48]


林苗苗等[49]对80例疑似社区获得性肺炎患儿的检测中发现,MP-DNA法诊断的灵敏度为53.70%、特异度为53.85%、阳性预测值为70.73%、准确率为53.75%,而SAT法的四个指标分别为87.04%、92.31%、95.92%和88.75%,表明SAT检测对MP感染的诊断灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及准确度均高于DNA检测。


其他研究[50-52]也表明SAT法对MP的检测灵敏度和特异度均高于培养法、血清检测和PCR法,在早期诊断中具有较高的应用价值,已在临床上广泛应用


另外,牛春密等[53]发现SAT法检测MP-RNA的转阴时间(3.0±0.9周)和临床痊愈时间(2.9±0.7周)呈正相关,RNA转阴时间越长,患者临床征象恢复时间也越长,且患者入院时各项相关炎症指标值越高。表明SAT与肺炎支原体肺炎临床症状和治疗效果具有相关性,可作为评估治疗效果和辅助判愈的指标,防止过度医疗[54-56]


目前,SAT法检测MP-RNA已在《儿童肺炎支原体呼吸道感染实验室诊断中国专家共识》[57]中被列为病原学一级推荐方法,此外《中国儿童肺炎支原体感染实验室诊断规范和临床实践专家共识》[58]、《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识》[59]、《儿童肺炎支原体肺炎中西医结合诊治专家共识》[60]等也充分肯定了其高灵敏度和疗效判断的价值


其他如,朱海燕等[2]建立了H1N1和H3N2两种甲型流感病毒的SAT检测方法,与血凝实验相比,SAT检测具有灵敏度高(提高104倍)、特异性强、准确度高、高通量自动化等优势。


另外,SAT技术因其恒温扩增的特点,易于实现自动化,目前,已配套自动化仪器检测新型冠状病毒SARS-CoV-2,实现了样本进、结果出的全程自动化检测,检测全程仅需90分钟出结果,大大缩短了检测时间[61]、节省了人工、降低了人工操作的感染风险


03
乙性肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)RNA检测的临床应用


研究显示,血清HBVRNA指标能够反应肝内cccDNA的活性,在乙肝治疗中具有与HBVDNA不同的疗效监测、预测等重要的作用[62,63],已被写入《慢性乙型肝炎防治指南》、《慢性乙型肝炎临床治愈(功能性治愈)专家共识》、《欧洲乙肝病毒感染管理临床实践指南》等国内外多个权威指南[64-66]


黄晨璐等[67]发现,在HBV DNA<100IU/mL的慢性乙型肝炎患者血清样本中,SAT法检测HBVRNA的阳性检出率为98.68%,qRT-PCR法为88.16%,SAT法较qRT-PCR法有着更高的灵敏度


类似的结果也在张缈曲等[68]的研究中被发现,在HBV DNA<100IU/mL的低浓度样本中,SAT法检出率为77.27%,而反转录PCR法检出率为59.09%。


由于HBV是DNA病毒,要进行HBV RNA检测,需要排除HBV DNA的干扰。如果使用PCR的方法检测HBV RNA,由于PCR不能识别基因组DNA和逆转录的cDNA,需要进行DNA酶处理,操作繁琐,且操作过程还会导致RNA降解,给临床检测带来诸多不便。而SAT技术直接以HBVRNA为靶标,不受HBVDNA的干扰,使其操作更为简便、灵敏度更高。


04
肠道病毒检测的临床应用


肠道病毒(enterovirus,EV)又称肠病毒,是一种主要寄生于肠道的正股单股RNA病毒。虽然名为肠病毒,在人类中却很少出现肠道的病状。近年在亚洲和北美洲流行、可以引起手足口病的EV71就是其中的一种[69]。肠病毒全球皆有分布,而人类是唯一宿主及唯一感染源。


Chen等[70]利用SAT技术检测肠道病毒71(EV71)。通过在SAT体系中加入外源RNA做为对照来质控提取和扩增的过程,避免假阴性结果的出现。研究分析了256例临床标本(包括60份临床确诊病例和196份疑似病例),结果表明,确诊病例的检出率为100%(60/60),疑似病例的检出率为47.4%(93/196),具有较高的灵敏度和特异性。


Xu等[71]利用SAT法建立了一种快速可靠的肠道柯萨奇A16(Coxsackievirus A16,CA16)病毒的检测方法,通过病毒株和临床标本来评估SAT的诊断性能特征。结果表明,SAT检测CA16-RNA的下限低至10copies/反应,检测病毒株的下限为10-1ffu/mL。204份临床粪便样本中,SAT法检测阳性例数为87例,其中82例的RT-PCR法结果阳性,5份不一致的样本以测序法进一步验证,其中4份为CA16病毒。结合RT-PCR和测序结果,SAT-CA16检测的灵敏度和特异性分别为100%和99.2%。


03
 应用前景


RNA扩增技术自出现开始,就应用于疾病诊断、流行病学监测、食品安全检测、动物病原体检测等领域[72]SAT作为RNA扩增技术具有方便快捷、高灵敏度、高特异性等优势。可以有效降低实验室污染,确保结果的准确性,避免假阳性和假阴性的结果。


此外,在病原体检测上可以区分死菌和活菌,有利于疗效监测和辅助判愈,为治疗方案提供参考,减少过度医疗。SAT法已在生殖道感染、呼吸道感染、血液感染和肠道感染等领域上表现出明显的技术优势,具有广阔的应用前景。




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王雅杰 教授

首都医科大学附属北京地坛医院检验科主任


主任医师、教授、博士生导师 

首都医科大学附属北京地坛医院检验科主任,美国波士顿大学访问学者。

发表中英文章百余篇,第1发明人授权专利21项,软件著作权7项,获2019年第13届北京发明创新大赛铜奖。参编论著17部。主持国自然面上、市自然、出国留学人员择优资助项目等课题。入选国之名医、白求恩式好医生、⽩求恩式检验⼈、北京市科技新星、首届北京医学会优秀中青年医师和北京市215工程等。

所在科室入选首届白求恩式检验科。

担任北京医学会检验学分会常委,中华医学会检验分会生化学组委员,首都医科大学临床检验诊断学系委员及第一届青委会副主任委员,中国研究型医院学会生物标志物专业委员会副主任委员及青委会主任委员,白求恩精神研究会检验医学分会理事会副秘书长及感染性疾病检验与临床专业委员会主任委员,北京中西医结合学会检验医学专业委员会常委、北京市自然项目评审专家等。

担任Annals of Translational Medicine 、《标记免疫分析与临床》、《中国实验诊断学》、《分子诊断与治疗杂志》等杂志编委,《中华检验医学杂志》、《中华实验和临床病毒学杂志》、《首都医科大学学报》、Analytica Chimica Acta、Analytical Letters、OncoTargets and Therapy、Cancer Medicine等杂志审稿人。 

来自: 检验医学
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