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HBV RNA检测技术盘点:RT-qPCR VS RNA捕获探针法

归去来兮 2021-4-7 45人围观 技术


慢性乙型肝炎影响着世界上超过2.4亿人口[1],难以治愈已成为公认的事实。


大多研究认为难以治愈与肝细胞核内HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)半衰期过长且难以清除有关。[2]因此,肝内检测cccDNA对评估抗病毒治疗疗效和治疗终点具有重要意义。但直接检测cccDNA十分困难,通常需要进行肝组织活检,具有创伤性,难以在临床上推广应用。如何真实地评估肝细胞内cccDNA的水平和转录活性,成为临床亟待解决的问题。


随着研究的增多,HBV RNA逐渐进入人们的视野。2019年《慢性乙型肝炎临床治愈(功能性治愈)专家共识》指出血清HBV RNA是反映肝内cccDNA转录活性的良好生物学标志物,可早期预测抗病毒治疗期间HBeAg血清学转换以及停药后病毒学复发和HBsAg逆转。[3]血清HBV RNA更是作为cccDNA的替代血清学指标被列入中国和欧洲乙肝防治指南[4,5],在评估抗病毒药物的疗效、NAs停药后复发风险、早期预测干扰素治疗应答等方面都具有重大临床价值。



血清HBV RNA指标在慢性乙肝患者诊疗过程的巨大优势已被越来越多的研究者所证实。有了新指标,该如何检测,成为大家接下来所关心的话题。今天检验君就和大家聊一聊血清HBV RNA检测方法那些事。


由于血清中同时存在HBV RNA和HBV DNA,因此检测HBV RNA需排除HBV DNA干扰,且保证HBV RNA不被降解,但在未治疗的慢性乙肝患者血清HBV RNA水平通常是血清HBV DNA水平的十分之一甚至是百分之一,因此HBV RNA检测需要高灵敏度方法。


关于HBV RNA定量检测技术,目前使用最多的主要包括反转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)RNA捕获探针法



RT-qPCR检测技术


该技术通常采用普通磁珠法提取血清样本或者血浆样本中的总核酸(包含HBV RNA和HBV DNA),经DNA酶消化去除HBV DNA的干扰,以获得HBV RNA。HBV RNA经逆转录后作为PCR扩增检测模板,利用针对HBV RNA序列设计的引物、特异荧光探针(通常TaqMan探针5'末端标记FAM荧光素),配以PCR反应液,通过收集到的荧光信号的变化联合采用一组标准品制定的标准曲线来实现HBV RNA的定量检测。



RNA捕获探针技术


该方法采用特异性磁珠捕获技术提取血清或者血浆中的HBV RNA,磁珠微粒表面偶联HBV RNA特异性捕获片段(探针),能特异性地与血液中的HBV RNA杂交,当捕获探针与HBV RNA结合后,用磁铁吸附磁珠,即可将HBV RNA特异性的提取出来,获得高纯度的HBV RNA作为待扩增检测的模板。


HBV RNA在逆转录酶作用下合成一条带T7启动子的双链DNA,T7RNA聚合酶以这条双链DNA为模板进行转录,每个DNA分子可以转录出100-1000个拷贝的RNA,转录出的RNA与特异性荧光标记探针结合发出荧光,被荧光检测仪实时检测到。与此同时,新转录的RNA继续在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下循环逆转录和转录过程。如此往复,进行高效扩增。



了解了上述两种方法的检测原理,我们应该选哪种方法检测?接下来我们看看它们有何优缺点。



RT-qPCR法 VS RNA捕获探针


RT-qPCR技术是一项较早应用于临床检测的成熟分子检测技术,在临床上应用广泛,但用于HBV RNA检测存在一定局限性,主要原因有:①DNA消化步骤不可避免地导致RNA损耗,降低检测的灵敏度;②消除不彻底时,残留的DNA和HBV RNA一同被扩增,影响定量的准确性。


相较于RT-qPCR技术,RNA捕获探针法无需DNA酶处理既能获取高纯度HBV RNA,避免因DNA酶处理造成HBV RNA损耗,同时在扩增环节引入T7启动子,确保特异性的扩增HBV RNA,确保检测结果的准确性。


此外,近期也有不少学者对于两种方法检测HBV RNA的性能进行了评估。


复旦大学附属公共卫生临床中心陈良教授团队一项研究收集212例慢性乙肝患者的血清标本,采用RNA捕获探针法和RT-qPCR法分别检测所有血清样本中HBV RNA。结果发现,在HBV DNA<100 IU/mL的血清样本中,RNA捕获探针法的HBV RNA阳性检出率为98.68%,RT-qPCR法检出率为88.16%。RNA捕获探针法检测灵敏度高于qRT-PCR法。[6]



此外,复旦大学附属华山医院感染科张文宏教授团队的一项研究收集170例慢性乙型肝炎血清标本,以评估RNA捕获探针法和RT-qPCR法对血清HBV RNA检测性能。结果发现,在HBV DNA<100 IU/mL血清样本中,RNA捕获探针法HBV RNA的检出率为77.27%,RT-qPCR法的检出率为59.09%。RNA捕获探针法检测灵敏度同样高于qRT-PCR法。[7]



与RT-qPCR法相比,RNA捕获探针法中特异性靶标捕获法磁珠提取技术只提取了病毒RNA,从而排除其他核酸或杂质的干扰,获得更高纯度的模板,且逆转录和扩增实时同步进行,扩增效率更高,扩增产物为RNA,降解快,还可大幅降低实验室污染风险。可看出,RNA捕获探针法的确是一种快速灵敏的HBV RNA定量检测方法,尤其在HBV DNA低浓度标本中表现更加突出



结 语


随着检验医学的不断发展,自动化带来了“检测系统”的概念,即检测仪器、试剂和校准品的一体化,可避免同一试剂在不同实验室配不同仪器所带来的结果不确定问题,自动化系统无疑将进一步提升检测质量。


目前国外IVD巨头已实现HBV核酸全自动检测,国内HBV核酸检测尚存在较大差距,目前主要是手工或者半自动操作。好消息是HBV全自动化检测国产化已经取得突破性进展,如仁度生物的AutoSAT全自动核酸检测分析系统,采用的正是RNA捕获探针法,灵敏度比传统RT-PCR技术检出率高10%以上,100分钟完成检测,大幅缩短TAT时间。


作为一个新的血清学标志物,HBV RNA神秘的面纱被一层一层的剥开,它对慢性乙肝患者的临床指导意义也受到人们广泛的关注与认可,对优化慢性乙肝患者的监测及管理,指导临床判断预后等方面都发挥着重要作用。随着快速灵敏的HBV RNA检测试剂与检测平台应用于临床,我们有理由相信彻底消除慢性乙肝的那天终将到来。


参考文献:

[1] Schweitzer A, Horn J, Mikolajczyk RT, Krause G, Ott JJ. Estimations of worldwide prevalence of chronic hepatitis B virus infection: a systematic review of data published between 1965 and 2013. Lancet. 2015 Oct 17;386(10003):1546-55.

[2]  Wei L, Kao JH. Benefits of long-term therapy with nucleos(t)ide analogues in treatment-naïve patients with chronic hepatitis B. Curr Med Res Opin, 2016 Dec 21: 1-32.

[3] 慢性乙型肝炎临床治愈(功能性治愈)专家共识[J].中华传染病杂志,2019(08):461-472.

[4] Clinical Practice Guidelines.EASL 2017 Clinical Practice Guidelines on the management of hepatitis B virus infection.European Association for the Study of the Liver.

[5] 慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)[J].中华传染病杂志,2019(12):711-736.

[6] 黄晨璐,许伟,胡乾坤,张小楠,李强,黄玉仙,陈良.实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价[J].微生物与感染,2020,15(03):158-165.

[7] 张缈曲,张琪然,张寒悦,喻一奇,仇超,张文宏.一种新型乙型肝炎病毒RNA定量检测方法的临床检测性能评估[J].中华传染病杂志,2020,38(12):782-785.

来自: 检验医学 | 作者:检验君
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