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手把手教你如何看“生化反应曲线”

归去来兮 2021-4-1 76人围观 技术


前言

生化反应曲线是整个生化反应过程的记录,通过查看反应曲线我们可以知道这个结果是否可靠,也可以发现一些仪器故障(试剂针加样不足、冲洗机构冲洗问题),也能提醒我们光源灯能量不足(俗称,换灯泡),也能查看速率法项目是不是底物耗尽。
那么,到底怎么去看生化反应曲线呢?

01

生化反应曲线基础理论



分光光度仪原理,运用的是朗伯-比尔定律:A=Kbc
A为吸光度,K为摩尔吸光系数,它与吸光物质的性质及入射光的波长λ有关,c为吸光物质的浓度,单位为mol/L,b为吸收层厚度,单位为cm。Lambert-Beer 定律适合于任何均匀非散射的介质,当相应的比色杯每一次通过光路系统时,光路系统会测量并记录下相应的吸光度。光路系统可以测量后分光后12个波长的相应吸光度。
常用波长: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm ,多数检测项目都使用双波长检测方法。(可去除干扰物对检测结果的影响)


全自动生化分析仪常用的方法:终点法和速率法。
1、终点法:(一点终点法、两点终点法)
被测物质在反应过程中完全被转变为产物,到达反应终点,根据终点吸光度的大小求出被测物浓度,称为终点法。
该法称为平衡法更为恰当。从时间-吸光度曲线来看,到达反应终点或平衡点时,吸光度将不再变化。终点法参数设置简单,反应时间一般较长,精密度较好。
 一点终点法在反应到达终点,即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值,用于计算结果。
结果计算公式:待测物浓度CU=(待测吸光度AU-试剂空白吸光度AB)×K
  K为校准系数  
两点终点法在被测物反应或指示反应尚未开始时,选择第一个吸光度,在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度,此两点吸光度之差用于计算结果。
2、连续监测法(速率法):
是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时,连续选取时间-吸光度曲线中线性期(各两点间吸光度差值相等)的吸光度值,并以此线性期的单位吸光度变化值(ΔA/min)计算结果。
可以确定线性期并计算ΔA/min,根据此值再准确地计算酶活性,因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法。连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度,一般是某些基于酶法测定的代谢物。
    酶活性(U/L)=ΔA/min×理论(或校准)K值。 
    代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值。 

1.反应曲线是什么?


炒菜,应该大家都会吧?


其实,生化项目的检测过程跟炒菜比较相似,炒菜的基本流程是:放油→放菜→放盐,如果每隔18秒,对菜的味道进行打分并记录,再把各个点连接绘成一条曲线的话,炒菜的反应曲线大致是这样的,见下图:



如果只是把油→菜→盐,按顺序放进锅里,这一锅菜应该是没法吃的,对吧?至少得在放油、菜、盐的时候用锅铲搅拌混匀一下,对吧?于是炒菜的反应曲线变成了这样,见下图:



那么,对应的生化项目检测(以奥林巴斯AU系列为例)是这样的:首先,仪器会向反应杯加入试剂1(R1),紧接着加入样本(S), 搅拌混匀,3分钟后加入试剂2(R2),搅拌混匀。在这个过程中,仪器会每隔18秒测试一次吸光度并记录,总共28(0-27)个点,然后连接成线,就是我们所看到的反应曲线,见下图: 



所以,反应曲线是项目检测整个过程的记录,相当于是一个静态的录像。


2.反应曲线怎么看?


在整个检测过程中,试剂1(R1)、样本(S)、试剂2(R2)加入以及搅拌的时间点都是固定的。我们知道了反应曲线是怎么来的之后,需要知道什么样的曲线算正常。


一般正常的反应曲线:a.比较平滑,无明显的跳点;b.加入R2前后吸光度会发生明显的变化(低浓度样本除外);c.终点法的反应曲线,会有一段曲线的吸光度基本无变化;d.速率法的反应曲线,基本成一条直线(两点速率法除外)。


生化的反应曲线可以分为终点法和速率法两大类,以下列举了一些正常的反应曲线供参考:


1)终点法的反应曲线:

反应到达终点后反应混合物的吸光度不再变化(R1主要用于消除干扰,R2加入之后,反应启动),就像你炒好的菜在一段时间内味道是不变的。如下图:




2)速率法的反应曲线:

随着反应的进行,吸光度越来越大,但速率保持不变,R2之后基本成一条直线,无明显跳点(两点速率法除外),如下图:


注:上图在加入R2之前为虚线,是因为R1+S的体积小于仪器要求的最低的反应总体积。



我们在看反应曲线的时候,眼里是一条曲线,脑袋里面浮现的应该是整个的检测过程,去还原仪器的动作,分析从什么时候吸光度突然变得异常。你可以想象成这盘菜是怎么炒出来的。


3.反应曲线有什么用,什么时候用得着?


1)结果出现负值(终点法项目):

a.反应曲线有可能是一条直线,样本或R2有可能没有加入;

b. R2加入之前的吸光度比加入后还高,试剂1和试剂2位置放反或者严重脂血标本。


2)结果明显偏低(速率法项目):反应曲线可能变成了类似于终点法的曲线,也就是我们通常说的底物耗尽,需要稀释重测。


3)试剂过期或污染、搅拌棒破损、携带污染以及冲洗站滴水也会在反应曲线上有所体现。


4)总之,在结果比较可疑的情况下,可以调出反应曲线看看是否正常,有助于找出问题所在。



4.注意事项:


1)不同厂家或型号的仪器,加入样本和试剂的顺序可能不同,比如,日立是S+R1+R2。


2)部分仪器横坐标是直接用时间表示,比如贝克曼LX/Dxc系列用的是秒,另外LX/Dxc系列的加样顺序有可能是R1+S+R2或者R1+R2+S。


3)部分仪器没有把各个点连接起来,所以看到的是由点组成的曲线。


4)看反应曲线时,注意纵坐标的刻度,就像远看是美女,近看就不一定了。


5)反应曲线界面还可以看到很多的信息,比如:光电校正、试剂空白、定标的时间以及每一点的吸光度,这些都会有助于判断结果异常的原因。所以,你应该已经意识到,当有人问为什么某项目的结果偏低、不正常时,仅凭一个结果是很难判断的。


05

常见正常反应曲线简易图


终点法

速率法

固定时间法

06

常见异常反应曲线


1、比色杯异常:



2、搅拌棒问题


3、冲洗站问题


4底物耗尽


07

如何避免底物耗尽带来的误差?



一方面,在审核报告时,要综合考虑整张报告单各个项目的结果,对有疑问或者矛盾的项目结果,要查看反应曲线,并及时与临床医生沟通,结合病人的情况评估检测报告是否存在偏差。


另一方面,可以借助生化仪上面自带的参数设置,设置好底物耗尽的相关参数,让仪器自动报警。


由于不同厂家的仪器所给定的参数不同,底物耗尽的参数大概分两种:


1. 线性度:一般厂家设定的线性度为 15%,其含义就是所有检测点的 O D 值与理想拟合曲线的线性相关度要在 15 %之内 , 超出这个范围就是超限 , 仪器对此结果就会报警。以图2为例,反应阶段读取的曲线是 b-c-d,而最后计算的曲线是 b-d,明显可以看出c点远离了 b-d 直线,c 点附近读取的吸光度都偏离大于 15%,仪器会报警。个人意见,15%的线性度有些大,最好设置在 10%以内,以保证结果的准确性。


2. 吸光度限值或者反应界限:也就是单位时间内吸光度的变化(上升或下降)不能超过多少,或者初始反应的曲线斜率不能超过多少,以保证在读取反应阶段的吸光度结束前,底物都还是充足的。但由于这个参数的设置跟底物的量,反应阶段开始和结束的时间设定等都有关系,因此这个参数没有定值,厂家一般不会给这个参数值(除非是封闭系统),因此如果要设置这个参数,需要检验人员自己用一个最大线性左右的样品,通过这个样品的吸光度变化来计算这个参数。


 

本文编辑:乐乐高

来自: 临床检验医学
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