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转氨酶超级全的血培养瓶报阳后处理流程

归去来兮 2021-3-25 105人围观 技术


   血培养需氧瓶报阳后应该怎么处理?每家实验室都有自己的流程。应该转种什么平板?涂片看到细菌却培养不出怎么办?假阳性怎么处理?上海长征医院周庭银教授出版的新书《血流感染实验诊断与临床诊治》第三版给予了充分的讲解。


需氧瓶报阳性处理流程


(1)涂片
血培养仪报告阳性后,取出血培养瓶,记录报警时间及观察生长曲线,将培养瓶颠倒混匀,用75%酒精消毒血培养瓶内盖,待完全干燥后用1ml无菌注射器抽取0.20.3ml培养物滴在两张玻片上,一张进行革兰染色,另一张备用(做瑞氏染色或弱抗酸染色),自然干燥或烘片机烘干固定。
(2)镜检与转种 查见革兰阳性球菌取培养物转种血琼脂平板,查见革兰阴性杆菌取培养物转种血琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板,查见真菌菌丝,直接转种沙保罗、真菌显色平板,并将凃片结果及时报告临床(危急值报告)。

     若查未见细菌,进行瑞氏染色并结合细菌生长曲线,确定是否假阳性(革兰染色与瑞氏染色均未见细菌可判为假阳性)
(3)细菌鉴定
1、革兰阳性球菌
如发现短链状、长链状、成双、成单等排列,拟考虑为链球菌属。见到矛头状排列、有荚膜的革兰阳性双球菌(有时呈单个、短链状)拟考虑为肺炎链球菌,这种细菌很容易误认为是革兰阳性杆菌,此时,不仅要注意细菌的单个形态,更要注意细菌的整体排列状态。镜下形态为革兰阳性球菌,葡萄状成堆、成双等短链排列,可能为葡萄球菌属。肠球菌呈链状排列,一般为3~5个一列。如发现革兰阳性、菌体为丝状、分枝菌,应考虑放线菌或诺卡菌。
2、革兰阴性球菌
如肾形成双排列时,疑似脑膜炎奈瑟菌。血培养一般比较少见,常见于脑膜炎奈瑟菌的感染,判断要结合脑脊液的培养结果。此类细菌在涂片中较肥大,一般为散在排列,需与不动杆菌相鉴别。
3、革兰阳性杆菌
革兰阳性杆菌形态分为大杆菌和小杆菌。如发现革兰阳性粗大杆菌,有芽孢,两端钝圆,应考虑枯草杆菌。如见到革兰阳性,菌体一端或两端粗大,呈棒状、不规则、栅栏状等排列,疑为棒杆菌。而小杆菌短小,疑似产单核李斯特菌,观察时要注意排列方式,易与肺炎链球菌相混淆。
4、革兰阴性杆菌
革兰阴性杆菌形态多样,有长杆菌、球杆菌以及弧形杆菌。肺炎克雷伯菌形态粗短,有时会有荚膜。铜绿假单胞菌形态细长。不动杆菌属和莫拉菌属呈革兰阴性球杆菌样,需与革兰阴性球菌相区别。如发现革兰阴性细小杆菌或者沙粒样成团簇状排列的细菌,则怀疑是布鲁氏菌、流感嗜血杆菌等。另外,有些破裂细胞碎片易被误认为是革兰阴性菌,但是革兰阴性小杆菌形态完整,二者要加以区别。
5、真菌
涂片染色为革兰阳性的酵母状,圆形或椭圆形,有时会出现较多的假菌丝,相互结交成团(偶尔会出现注射器抽吸时发生针头被堵塞的情况),可能为白念珠菌、新生隐球菌等其他真菌。
 涂片革兰染色在多数情况下都能找到病原菌,但也有一些涂片很难发现病原菌,由于病原菌与破碎细胞碎片和(或)染液残渣混在一起,不易被发现。周庭银研究发现,可重新涂片作瑞氏染色,若有细菌镜下可见形态清楚、着紫色的细菌,完整的红细胞(图3-1),若瑞氏染色无细菌(图3- ),可以确定假阳性。但是瑞氏染色涂片不能辨别病原菌的革兰染色属性,可根据革兰染色背景判断是革兰阳性菌还是阴性菌。

血培养阳性培养物直接涂片

图3-血培养阳性培养物涂片各种形态

(4)结果解释
1.若涂片查见革兰阴性杆菌,转种血琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板48h后不生长,疑似不严格厌氧菌,取培养物再转种厌氧血琼脂平板或普通血琼脂平板,置厌氧环境培养24h48h观察生长情况;若厌氧环境不生长,可自制血琼脂平板重新转种。
2.若涂片查见革兰阳性球菌,转种血琼脂平板48h后不生长,疑似乏养菌。取培养物重新转种用金黄色葡萄球菌点种做卫星试验,若卫星试验阳性,进一步鉴定菌种;若仍不生长,疑似不严格厌氧菌(置厌氧环境培养),若再不生长可自制血琼脂平板重新转种。
  3. 假阳性为血培养仪器报警后,培养物涂片镜检未查见细菌,采用瑞氏染色若仍未查见细菌,没有生长曲线。若确定假阳性后,还需转种血琼脂平板并将血培养瓶放回培养箱中继续培养2448h后观察生长情况。若未见细菌生长,血琼脂平板还需延长培养714天(考虑有无支原体、分枝杆菌属、真菌、组织荚膜胞浆菌及巴尔通体等病原体的可能)。
4.假阴性为血培养仪器不报警,取培养物涂片查见细菌,转种血琼脂平板有细菌生长。
5.值得一提的是,血培养报阳后应该先涂片,根据涂片革兰染色结果选择转种相应的培养基。但是有些单位转种与涂片染色同时进行,往往造成培养基的浪费。因为涂片镜下见到革兰阳性球菌以及确定假阳性,只需转种血琼脂平板,无需转种其他两块平板(麦康凯平板和巧克力平板);查见真菌菌丝,直接转种沙保罗、真菌显色平板,不再转种三块平板(血琼脂平板、麦康凯平板和巧克力平板)。所以不推荐转种与涂片染色同时进行。
6.在临床上患者有感染症状,实验室检查感染指标,如降钙素原、C反应蛋白、白细胞等显示增高,但多套血培养无细菌生长,应考虑生长缓慢的特殊病原体,将没有报警的血培养瓶取培养物涂片(排除假阴性),若涂片未找到细菌,将血培养瓶放回培养箱延长培养,再与临床沟通重新送血培养作延长培养7~14
7.自制血琼脂平板方法:从未使用过的血培养瓶中取20ml液体,琼脂0.24克混匀,高压灭菌12115分钟,冷却50℃后加入1ml羊血或人血,倾注平板。
8.质谱测定:血培养阳性肉汤通过分离胶离心富集细菌后进行直接质谱测定,可以明确病原体。

处理流程图

注:“BAP”为血琼脂平板、“CAP”为巧克力琼脂平板、“Mac”为麦康凯琼脂平板
+”为有细菌生长,“-”为无细菌生长 
 
血培养阳性标本涂片手工操作仍不能缺少。涂片染色结果不仅为临床诊断提供有价值的信息,而且对微生物鉴定全过程起到导向作用。

厌氧瓶报阳性


(1)涂片
血培养仪厌氧瓶阳性报警后,取出培养瓶,并记录报阳时长并观察生长曲线,将培养瓶混匀,用75%酒精消毒血培养瓶瓶帽,待完全干燥后,使用无菌注射器从厌氧瓶中取培养物接种在厌氧血琼脂平板上,同时将培养物滴在两张玻片上,一张进行革兰染色,另一张备用(做瑞氏染色),自然干燥或烘片机烘干固定、革兰染色、镜检,若镜下查见细菌,将涂片结果报告临床(危急值报告)。

(2)镜检与接种
若镜下查见革兰阴性菌或革兰阳性菌,从厌氧瓶中取培养物接种厌氧血琼脂平板和需氧血琼脂平板,分别置厌氧环境(厌氧盒、厌氧罐、厌氧气袋、厌氧培养箱)和需氧环境35℃培养2448h,观察生长情况。
若查未见细菌,进行瑞氏染色并结合细菌生长曲线,确定是否假阳性?若确定假阳性后,厌氧血琼脂平板置厌氧环境,培养2448h后观察生长情况,将血培养瓶放回培养箱中。

(3)培养
培养2448h后,打开两种血琼脂平板观察,若厌氧环境生长,需氧环境不生长,初步考虑厌氧菌。再从厌氧血琼脂平板上挑取菌落接种在三块血平板(厌氧血琼脂平板、两块需氧血平板),分别置需氧环境、厌氧环境和二氧化碳环境培养2448h,观察生长情况。见图4-

注:“+”为有细菌生长,“-”为无细菌生长,“d”为不生长或生长不佳
(4)鉴定
1.初步鉴定
挑取厌氧血琼脂平板上菌落涂片,根据菌落特征和镜下形态,可以初步推测厌氧菌的种类(表 )。


2、仪器鉴定

(1)选择鉴定卡片,用棉签从厌氧血琼脂平板上挑取菌落制成菌悬液,使用VITEK-ANCMicroScan-RAIDIATBR-APID ID32A等自动微生物鉴定系统鉴定,4h即可判断结果。

(2)API 20A 鉴定系统:该系统是一种半定量的微量鉴定系统,也可用于检测细菌酶的活性。

3MALDI-TOF鉴定

4测序技术

(4)结果解释
1.在需氧血培养瓶、厌氧血培养瓶均报警,涂片均为革兰阴性杆菌时,需氧瓶转需氧血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、巧克力琼脂平板,厌氧瓶转需氧血琼脂平板,但厌氧瓶只接种需氧血琼脂平板需氧培养是不够的,若遇到革兰阴性厌氧菌和兼性厌氧菌同时存在的情况,且在涂片形态上没有明显差异,这样会造成厌氧菌漏检。因此除了接种需氧血琼脂平板需氧培养,还需增加一块厌氧血琼脂平板置厌氧环境,可以避免厌氧菌漏检。
2.厌氧血培养瓶阳性报警、需氧血培养瓶不报警,接种厌氧和需氧血琼脂平板分别置厌氧和需氧环境培养,若两种平板均生长,尤其要仔细观察厌氧血琼脂平板的菌落,有时会发现需氧菌生长优势,易覆盖菌落太小的厌氧菌,不易发现,需用放大镜观察菌落。
3.多数厌氧菌生长速度较需氧菌缓慢,血培养仪需要35d报警阳性;但梭菌属拟杆菌属、普雷沃菌属生长速度与肠杆菌科细菌相近,多数可在48h内报警阳性。血培养仪设置5d为培养周期,仅满足临床主要厌氧菌生长,如临床考虑特殊厌氧菌感染,可手工设置延长培养时间。
4.有些兼性厌氧菌在厌氧瓶中报阳时间早于需氧瓶(如肠杆菌科细菌);有些苛养菌在厌氧瓶中比在需氧瓶中生长好(如肺炎链球菌),甚至部分苛养菌在需氧瓶中不生长。
5.若发现血培养瓶瓶帽明显鼓出,说明瓶内细菌产生大量气体,需先在生物安全柜中放气,需然后再抽取培养物防止液体喷出。
6.有些革兰阳性菌,如梭菌、消化链球菌和杆菌等,若培养时间较长,可能变为革兰阴性菌,可用拉丝试验鉴别(3KOH滴于玻片上.1环细菌与之混匀,60s用接种环轻轻挑起,能拉丝为革兰阴性菌,不能拉丝为革兰阳性菌)。
7.值得一提的是,有些实验室因厌氧血琼脂平板用量少、购置难而不愿开展厌氧菌血培养。建议用普通血琼脂平板暂代厌氧血琼脂平板,若厌氧血培养瓶报阳,取培养物接种两块普通血琼脂平板,一块置厌氧环境,一块置需氧环境,若2448h后两块平板都生长为兼性厌氧菌;若厌氧环境平板生长,需氧环境平板不生长为厌氧菌;若两个环境平板都不生长,再购置厌氧血平板或自制厌氧血平板。
8.血培养瓶涂片及接种务必在生物安全柜内进行,尤其是3天以上报阳性的血培养瓶以避免布鲁菌等细菌气溶胶污染的风险。

血培养阳性直接药敏试验

一、直接药敏试验方法
根据血培养革兰染色的属性或培养物直接质谱结果选择药敏所用培养基(MH或含5%羊血MH琼脂平板),取阳性培养物23滴(100150μL)滴到MH平板上。再用无菌棉签均匀涂布于琼脂表面,根据革兰染色镜检或血培养直接质谱结果选择所用抗菌药物的纸片:革兰阳性球菌,葡萄状成堆、成双、成单等短链状排列疑似葡萄球菌,单个、成双、链状排列疑似肠球菌,矛头状排列的革兰阳性双球菌,呈单个、短链状疑似肺炎链球菌,选择相应的革兰阳性球菌抗菌药物纸片(见表3-2)。
见到革兰阴性粗短的杆菌,疑似大肠埃希菌,粗短、有荚膜疑似肺炎克雷伯菌,形态细长的杆菌疑似铜绿假单胞菌,选择相应的革兰阴性杆菌抗菌药物纸片(见表3-3)。置35℃或354-6%CO2,除铜绿假单胞菌培养6h8h以外,其他细菌培养4h6h8h读取初步药敏结果(图3-1),判定折点参见血培养瓶阳性培养物纸片法直接药敏试验(RAST)(表3-2、表3-3)。
直接药敏报告后,次日选择纯培养细菌再进行药敏试验和菌株鉴定,随后发出正式报告。

图3-1的直接药敏结果
 
二、直接药敏试验的质量控制
直接药敏试验质控操作按照欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EUCAST)规定进行。方法如下:
1 mL浓度为100 ~ 200 CFU/mL(0.5 McF,稀释1: 100000)的质控菌悬液加入血培养瓶中,再加入约5 mL无菌血液。置血培养仪中培养,若报阳,根据RAST方法进行处理,培养4h6h8h后观察结果。抑菌圈质控范围及目标值见表3-1


 血培养阳性瓶直接快速药敏试验不同菌种的判定折点见表3-2、3-3


金黄色葡萄球菌*:诱导性克林霉素试验:克林霉素和红霉素纸片间距12mm(两纸片边缘间距);在6h-8h后观察“D”抑菌圈,阳性结果可信,但阴性结果不能确定没有诱导耐药性;对于克林霉素试验,需单独贴克林霉素纸片(红霉素纸片的活性可能会干扰克林霉素试验的抑菌圈)
粪肠球菌a:粪肠球菌对氨苄西林耐药罕见,可通过MIC试验验证;氨苄西林、阿莫西林和哌拉西林加或不加β-内酰胺酶抑制剂,其敏感性可以通过氨苄西林敏感性推断;b:直接药敏试验难以区分模糊的抑菌圈边缘,利用直接药敏表中列出的折点可以检测由vanA引起的万古霉素耐药性和折点,但可能遗漏一些vanB介导的耐药性
屎肠球菌*:直接药敏难以区分模糊的抑菌圈边缘;利用直接药敏表中列出的折点可以检测由vanA引起的万古霉素耐药性,但可能遗漏一些vanB介导的耐药性
肺炎链球菌a:对于对苯唑西林敏感的分离株,报告所有EUCAST临床折点表(标准方法)中有折点的β-内酰胺类药物(包括注释中的药物)为“敏感”;对于苯唑西林耐药的临床株,注意β-内酰胺类的耐药性,并进行标准药敏方法验证;b:诱导性克林霉素试验:克林霉素和红霉素纸片间距≤12mm(两纸片边缘间距);在68h后观察“D”抑菌圈。阳性结果是可信的,但阴性结果不能确定没有诱导耐药性;对于克林霉素试验,需单独贴克林霉素纸片(红霉素纸片的活性可能会干扰克林霉素试验的抑菌圈)
 

大肠埃希菌*:产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)或碳青霉烯酶菌株的筛查折点尚未得到确认;表中列出的折点是临床折点,耐药株或在技术不确定区(ATU)中的菌株可能怀疑β-内酰胺酶介导的耐药

肺炎克雷伯菌*:产ESBL或碳青霉烯酶菌株的筛查折点尚未得到确认;表中列出的折点是临床折点,耐药株或在ATU中的菌株可能怀疑β-内酰胺酶介导的耐药

陈众摄
四、结果解释
(一)血培养是临床诊断菌血症和脓毒症的关键指标。利用直接法进行药敏试验,在血液培养仪报警后4h6h8h就可将初步的药敏结果报告给临床医生,可以尽快的精准治疗。直接药敏试验虽然不是正式的临床报告,但是可以尽早指导临床用药,及时控制患者的病情,减轻病人的痛苦,遏制细菌耐药产生,减少了并发症和院内感染,降低患者住院费用,应大力推广应用,但是目前由于收费等诸多原因限制了该项目在临床的使用。
(二)药敏纸片抑菌圈的大小往往会受到细菌接种量的影响,通常情况下接种的细菌过多则抑菌圈偏小,接种的细菌过少则抑菌圈偏大。由于培养物中细菌的量是未知的,如药敏平板上细菌生长过稀或过密,可影响直接药敏试验结果。故在做直接药敏试验前,应在革兰染色涂片镜检时对细菌的量有初步的了解,这样可以对培养物接种量加以调整。
(三)观察药敏平板抑菌圈直径时,遇到抑菌圈边缘模糊难以判断的情况,不能对着强光,而要将平板置于黑色背景下观察(若链球菌MHF在白背景阅读),便于看清抑菌圈的准确范围。

来自: 临床微生物论坛
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