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收藏!PCR异常扩增曲线分析攻略

归去来兮 2021-2-25 134人围观 技术

本文来源:赛默飞生命科学服务平台(ID:ABI2017315)


近几年,从科学研究到临床检测,从“非洲猪瘟”检测到“新冠病毒”检测,荧光定量PCR仪器已成为分子生物学研究的常规设备。检测方法的迅速发展,检测任务的紧急也对检测人员提出了更高的要求,需要他们具备熟练判断数据结果的能力。对于荧光定量PCR的结果的判断,最直观的判断就是看扩增曲线是否正常。很多老师在平时实验中会遇到异常扩增曲线的困扰,比如打折的扩增曲线、复孔间重复性不好、阴性样本扩增曲线抬升等。面对异常的扩增曲线,大家也不用担心,接下来我们会结合几个实例,带着大家一起来看一下比较常见的异常扩增曲线的分析攻略。


1

确认软件设置是否正确

对照试剂盒说明书,检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是,需要看下所选用的试剂中是否含有ROX来作为参比荧光染料。Applied BiosystemsTM系列荧光定量PCR 仪器可以用ROX来作为参比荧光染料,用以校正仪器系统以外的物理误差,比如均一化校正由于移液误差或者蒸发导致的批内体积误差等。


目前市面上有的的荧光定量PCR预混液是不含有ROX的,当用此类试剂的时候,应该将ROX参比功能关闭,否则可能会出现图一左图所示的,扩增曲线异常的现象。遇到这种问题,可以在Plate Setup设置中找到Passive Reference,把ROX改为None,重新分析一下,结果就变正常了(图一右图)。Applied BiosystemsTM系列荧光定量PCR 仪器默认是对所有荧光通道及所有样品孔进行荧光采集,用户不用担心数据丢失,实验完成后,还可以对设置错误的反应孔的荧光通道、样品名称等进行更改。



图一:使用不含ROX试剂,忘记更改Passive Reference结果图及更改后的结果图



还有一些结果,多组分图扩增曲线没有抬升,是很明显的阴性样本,但是扩增图谱的扩增曲线抬升了,这样就会与阈值线相交,反而有了CT值。这是由于软件在进行基线自动扣除的时候出现错误,引起了扩增曲线抬升(图二)。出现这种情况可以采取手动调整基线的方法,重新定义基线即可正常,即将基线起点改为荧光信号稳定的循环数(一般是3),基线终点要改成扩增曲线起峰的前一个循环数(比如起峰是在第25个循环,那基线的终点就是24)。引起这样的原因是由于选用的耗材、试剂或者操作的原因导致背景荧光信号有所波动,从而造成反应孔的自动基线扣除错误。


图二:基线自动扣除错误,导致扩增曲线抬升


2

确定耗材及仪器配件是否使用正确

耗材对于荧光定量PCR来说比较重要,很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。常见的耗材相关问题包括:


1)错误使用成普通PCR仪器所对应的耗材

普通PCR耗材一般透光度比较差,会造成荧光扩增曲线异常,比如打折的扩增曲线(图三);


图三:错误使用普通PCR耗材的结果



2)未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材


目前Applied BiosystemsTM系列荧光定量PCR 仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种,实验前一定要确定自己的仪器是哪一种加热模块,再来选择对应的耗材。如果0.1ml加热模块用成0.2ml耗材,则会造成耗材压扁,甚至造成机器故障;如果0.2ml加热模块用成0.1ml耗材,则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触,从而出现热传导不充分,进而影响酶的活性,会引起重复性不好(图四),或者溶解曲线多峰(非特异扩增),甚至是假阴性结果;


图四:耗材规格跟加热模块不匹配造成重复孔间差异




3)使用了质量比较差的耗材


Applied BiosystemsTM系列的荧光定量PCR仪器是一个开放的平台,客户可以使用开放的试剂、开放的耗材。但是目前市面上荧光定量PCR耗材种类繁多,质量也是良莠不齐,在耗材选择上尽量选择质量、品牌好一点的,切莫因为便宜选用质量很差或不符合要求的耗材,否则会引起一系列问题,引来实验的困扰,造成不必要的时间、精力和试剂、样本的浪费。比如质量不好的耗材可能会引起荧光值不稳定,这会造成反应孔的自动基线扣除错误,得到不准确的CT值(图五左图),更换质量好的耗材后,荧光信号正常(图五右图);


图五:质量不好的耗材引起荧光值不稳定图及更换Applied BiosystemsTM耗材后结果




如果使用的PCR反应板封膜质量不好,在PCR过程中受到水蒸气的影响,容易产生变形(图六),这样会引起“optical warping”,即“光学扭曲”现象(图七 左图),该实验中由于使用了ROX作为参比染料,ROX有效的校正了这种荧光信号的变化,均一化的扩增图结果是正常的(图七 右图)。

图六:PCR过程中水蒸气使得封膜变形


图七:光学扭曲结果图及ROX均一化结果图



除了耗材外,跟仪器配套使用的配件也要检查是否使用正确,比如QuantStudio 5配套的8联管托架,在使用的时候只用托架的下半部分,如果忘记把上半部分取下,有可能会影响扩增(图八)



图八:未将托架上半部分取下,造成有些靶标未扩增


3

确定所用试剂是否正常

如果设置都正确,耗材及配件也都没问题,但是扩增曲线还是异常,这时候要确定下所用试剂是否正常。首先要确定试剂是否有效,包括查看试剂是否在有效期内,是否反复冻融多次,运输条件是否正常。可以通过比较试剂的批次号,结合实验中的阳性对照结果,确定试剂的有效性。


其次要观察扩增完的试剂体积,如果在扩增过程中有试剂的蒸发,可能会引起扩增曲线抬升现象,如果实验体系中加入了ROX作为参比荧光,ROX荧光可以区分扩增曲线抬升是真扩增,还是蒸发。比如反应体系存在蒸发,水分丢失,ROX浓度会增加,ROX参比荧光上抬(图九左图),而正常孔中ROX荧光会一直不变(图九右图),所以在加完试剂上机前,一定要检查耗材是否已经密封,防止试剂蒸发,试剂蒸发严重的还可能导致整个实验室的气溶胶污染。


图九:试剂蒸发引起扩增曲线抬升


4

确定实验过程中的操作细节

如果以上都正常,还要确定下实验过程中的操作细节。比如在做标准曲线的时候是否是梯度稀释的标准品,如果不是梯度稀释标准品,可能会引起标准曲线扩增效率或R2值异常;从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀,如果试剂融化后没有混匀,这时候取出的试剂不是均一的,会影响后面的扩增;定量PCR预混液跟核酸模板加好后是否混匀,如果没有混匀,特别是样本体积比较大的时候(超过PCR体系的20%),更容易发生optical mixing现象。因为样本是水相会在上层,试剂(含有甘油成分)会在下层,在前期的PCR过程中不足以混匀完全,这样会形成折射,荧光较强,而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀,荧光就变稳定了(图十)。

图十:样本跟预混液未混匀现象



还有上机的反应体系里尽量不要有大的气泡,有气泡的话,中间容易形成折射,干扰荧光的采集(图十一)。所以实时荧光定量PCR实验的细节还是要特别注意的。

图十一:反应体系中有气泡


以上是我们在面对常见的一些异常扩增曲线的分析思路,希望能够帮助各位老师处理扩增曲线异常的问题。除了我们提到的几种情况之外,在平时实验过程中我们可能还会遇到“千姿百态”的异常扩增曲线,大家可以利用上面介绍的思路加以分析。

来自: 赛默飞生命科学服务平台
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