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磁珠残留对新冠核酸检测结果的影响,到底有多大?

归去来兮 2021-2-24 176人围观 技术


作者:李宝林  刘靳波

单位:西南医科大学附属医院医学检验部


国家卫健委临检中心新冠核酸检测第二次室间质量评价报告数据显示,有2166家单位使用磁珠法提取核酸,占整个参加质评实验室的86.92%;可以说,磁珠法提取核酸是目前市场上使用率、占有率最高的一种核酸提取方法。核酸提取仪提取超过一定次数后会出现磁珠残留现象,即提取好的核酸中混有磁珠。磁珠残留对新冠核酸检测结果到底有没有影响?影响有多大?


案例经过


2021年1月28日工作人员发现一台核酸提取仪右侧模块提取好的核酸中有磁珠残留(如图1),于是在扩增过程中做了一个磁珠残留对扩增影响的比对。结果显示,磁珠不管残留与否,内标均能扩增出来(ps:本实验室使用的内标为外源性内标,即提取时加入的人工合成的基因片段),见图2。


图1 核酸提取中的磁珠残留现象,上图为提取后的核酸混有残留的磁珠,下图为扩增后扩增管中残留的磁珠。


图2 磁珠残留对核酸扩增的影响,左图为无磁珠残留扩增的内标,右图为磁珠残留扩增后的内标。


根据这个实验结果,绝大部分工作人员认为磁珠残留对新冠核酸检测没有影响,毕竟两者之间相比,内标没有明显差异性;但是也有少数人认为这只是阴性样本的验证,阳性样本有待进一步验证。大家各持一面,最后一致认为让数据说话,做阳性样本验证。


但摆在面前最大的困难是没有阳性样本,参加室间质评的样本也没有剩余,性能验证使用的是企业参考品,刚刚够做性能验证。能够使用的只有室内质控品,本实验室购买的是广州邦德盛中值室内质控品,平均值为2.82E+04 copies/mL,X±2SD为9.01E+03~8.83E+04 copies/mL。室内质控品不是参考品,说明书提供的平均值也只能起参考作用。如果要全面评估磁珠残留对核酸扩增的影响,应该评估不同浓度梯度。



首先,验证正常情况下,不同浓度梯度核酸扩增情况。将室内质控品制成不同浓度梯度的阳性样本,每个浓度8个样本,使用另一台同型号核酸提取仪提取核酸,然后进行扩增,见表1。


表1.不同浓度梯度ORF1ab基因、N基因、E基因Ct值(平均值±标准差)


验证结果证明,在这四个稀释浓度情况下,没有磁珠残留能够有效的扩增出ORF1ab基因、N基因、E基因。接着在出现磁珠残留的核酸提取仪提取核酸,并进行扩增,每个浓度重复16个样本,见表2。


表2.有磁珠残留不同浓度梯度ORF1ab基因、N基因、E基因扩增情况分析

备注:所有的样本内标均有扩增,平均值±标准差为29.21±1.51。


通过数据可以看出,磁珠残留对阳性样本核酸扩增有明显影响,ORF1ab基因、N基因、E基因都会出现不同程度的无扩增,且随着样本浓度的降低,这种影响愈加明显。


总结


在本次实验中,虽然磁珠残留对内标扩增没有影响,如果我们以内标扩增是否成功作为判断实验成功的标准,很有可能在这种情况下导致阳性样本的漏检,即假阴性的发生。


目前,每个实验室核酸检测任务都很重,在大批量检测样本情况下,会发生各种各样的问题,我们认为在实验过程中遇到任何的异常情况都应该引起足够重视,找到原因,全面评估异常情况对结果的影响。


在本次验证磁珠残留对新冠核酸检测影响的实验中,我们仅仅用本实验室使用的扩增试剂进行了验证,也只能验证本实验室使用的核酸提取仪,难免有偏颇之处,也希望更多的同行遇到类似问题积极探讨,一起解决新冠核酸检测中遇到的问题。


来自: 检验医学网
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