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梅毒TPPA试验:阴性对照孔阳性,实验孔强阳性凝集!到底哪做错了?? ... ... ...

归去来兮 2020-12-15 121人围观 技术

来源:广元市中心医院检验科


梅毒是由梅毒螺旋体感染引起的一种几乎可以侵犯全身所有器官而产生多种症状和体征的慢性传染性疾病。


梅毒血清学试验包括非特异性梅毒螺旋体试验和特异性梅毒螺旋体试验。


非特异性梅毒螺旋体试验如梅毒血浆反应素快速试验 (RPR TRUST),不加热血清反应素试验 (USR),和性病研究实验室试验 (VDRL),其抗原成分属于类脂抗原,抗类脂抗原抗体即是反应素,机体感染梅毒后产生反应素能与非特异性梅毒螺旋体试剂发生反应凝集,该类方法可用作梅毒螺旋体感染后治疗的效果评估。


特异性梅毒螺旋体试验有梅毒螺旋体血球凝集试验如 TPPA 试验,是以梅毒螺旋体精制菌体包被在人工载体明胶粒子上作为抗原,去和梅毒患者血液中特异性抗体产生凝集反应,可避免血清样本钝化和溶血带来的影响。在临床实验室 TPPA 试验由于其敏感性和特异性都非常高受到广泛应用,并且可作为梅毒确证的依据。


最近我遇到了一例 TPPA 试验阴性对照孔为阳性凝集(+),而实验孔为强阳性凝集(++)的 「奇怪」 梅毒病例~



一、案例经过


在值班时我收到一例门诊患者的血标本,其检验项目为梅毒螺旋体抗体(TPPA+TRUST) 试验,TRUST (甲苯胺红不加热血清试验)。


在实验中发现该患者 TPPA 试验阴性对照孔为阳性凝集(+),而实验孔为强阳性凝集(++),如下图所示:


T1 为该患者的试验结果



二、案例分析


1. 首先,排除实验操作错误


我看到实验结果后很是诧异,马上进行回顾分析,难道是操作失误导致实验失败?于是我又重做了一遍,我认真核对每一步,确保操作没有问题,然而两个小时后实验结果与第一次结果无异,我很纳闷,哪里出问题了呢?


2. 多种检测方法结果对比


为了进一步明确实验结果,我又做了北京万泰的 TRUST 试验、罗氏 Cobas601 化学发光试验,厦门英科的胶体金试验,如下图所示。


患者 TRUST 试验的结果


      患者化学发光试验的结果

 

     

患者胶体金试验的结果


结果 TRUST 试验呈阴性,化学发光试验、胶体金试验都呈阳性。鉴于化学发光法的高灵敏度与胶体金法的高特异性,于是我心想这可能是一个继往梅毒感染或极早期梅毒感染患者(不同检测方法对比可参考往期推文:我又被临床投诉梅毒检测结果,对不起,这个锅我们检验科不背!),但是不能就凭这样出我们的检验报告结果。


3. 吸收实验验证 TPPA 检测结果


阴性对照孔加入的试剂是未致敏粒子,若出现阳性反应,一方面可能是未致敏粒子被致敏粒子污染,另一方面可能是血清中存在某种不明抗体,该抗体恰好能够匹配未致敏粒子的抗原决定簇,发生抗原抗体反应,出现了假阳性结果。


首先,验证未致敏粒子是否被致敏粒子污染


介质对照实验步骤:孔 1 中加入 25μL 血清稀释液后加 25μL 未致敏粒子 ;孔 2 中加入 25μL 血清稀释液再加 25μL 致敏粒子,置室温 2 小时。


未致敏粒子 VS 致敏粒子


两孔都正常凝集,证明未致敏粒子与致敏粒子自身没有问题。


阳性对照实验步骤:在孔 1 中加入 100μL 血清稀释液和 25μL 阳性对照血清,孔 2、3、4 分别加入血清稀释液 25μL,然后从孔 1 吸 25μL 混合液以  2n  方式依次稀释到孔 4 后 25μL 吸弃,孔 3、孔 4 分别加入未致敏粒子、致敏粒子,置室温两小时。结果如下图:



孔 3 阴性,孔 4 阳性结果,说明未致敏粒子未被致敏粒子污染。


其次,验证血清中是否是存在干扰实验的不明抗体


患者样本对照实验步骤:在孔 1 加入 100μL 血清稀释液和 25μL 患者血清,孔 2、3、4 分别加入血清稀释液 25μL,然后从孔 1 吸 25μL 混合液以  2n 方式依次稀释到孔 4 后 25μL 吸弃,孔 3、孔 4 分别加入未致敏粒子、致敏粒子,置室温两小时。结果如下:



结果依然是阴性对照孔呈阳性凝集,孔 4 的实验孔呈现强阳性凝集。


吸收实验操作步骤:取用溶解液调制好的未致敏粒子 0.95ml 至小试管中,加入患者血清样本 50μL 充分混匀后在室温 25℃放置 30min , 充分吸收患者血清样本中不明抗体。然后 2000rpm 5min 离心 , 取上清液 25μL 至孔 1 中,作为阴性对照;再取上清液 25μL 至孔 2 中并加入 25μL 血清稀释液,混匀后吸弃 25μL 混合液作为实验孔;最后分别在孔 1、2 中加入25μL 未致敏粒子、致敏粒子,置混合器震荡 30s,室温静置 2 小时。结果如下:



通过吸收试验,在血清样品中加入大量未致敏粒子,为血清不明抗体提供了大量的不明抗体结合位点。抗原抗体充分反应后,通过离心,极大程度降低或消除了血清中不明抗体含量,从而避免血清不明抗体结合到明胶粒子上出现假阳性反性。吸收实验后,对照孔 1 阴性,试验孔 2 依然出现了阳性凝集结果,故最后判断该患者为梅毒螺旋体抗体阳性。



三、案列总结


确认结果后询问患者病史,有大量用药史且具体不详,其他无特殊。我们推测阴性对照孔中出现阳性凝集可能是之前的不明用药产生了不明抗体。在 TPPA 试验中所用的未致敏粒子是经过单宁酸处理的明胶粒子,我们推测可能是抗明胶粒子或抗单宁酸抗体,通过吸收试验用大量的未致敏粒子结合掉血清中非特异性不明抗体再通过离心很大程度降低或者消除了血清中非特异性不明抗体含量,使我们在吸收试验后的梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验得到了准确的结果。


在工作中如遇到这类罕见的 TPPA 模式,即阴性对照孔出现阳性反应,并且用对照试验排除人为、试剂的原因,很有可能是血清中出现了非特异性的不明抗体。这时如果是一位非梅毒螺旋体感染者的血清中恰巧出现了非特异性不明抗体,为避免发出错误的检验结果,我们可以通过吸收试验吸收这些不明抗体来排除干扰,使检验结果更加准确可靠。

来自: 检验时间 | 作者:杨耀
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