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鲁炳怀:国内病原学检测难点与希望并存……为何有的mNGS检测结果「南辕北辙」?这两个 ...

归去来兮 2020-12-7 141人围观 技术


临床病原学检测的方法,传统方法包括涂片、显微镜检、血清学、传统培养的方法。对于阳性的培养物,我们可以用MALDI-TOF MS进行菌种鉴定。


最近几年发展较快的是分子生物学检测方法,包括传统PCR、多重PCR、快速PCR等。最重要的发展包括宏基因组测序(metagenomic Next Generation Sequencing,mNGS)技术的应用,经过近几年医务人员、测序公司以及科研机构大力推荐和研发后,已慢慢走入临床工作。

 

呼吸道感染诊断国内临床多应用传统的培养手段与PCR等分子生物学检测,但难点与遗憾并存



呼吸道感染的诊断非常重要,并且是难点问题。人体的呼吸道与外界相通,其病原学类型非常复杂,既包括细菌、真菌,也包括病毒,甚至寄生虫的感染。目前的实验室对于细菌诊断而言可能技术相对比较成熟,但对一些少见的细菌感染,比如诺卡菌、非结核分枝杆菌,诊断能力还不够。真菌方面,除了传统真菌培养,隐球菌采用隐球菌荚膜多糖抗原试验、曲霉菌采用GM试验等提高了诊断率,但是在分子生物学诊断方面,没有更好的手段。分子生物学检测对于真菌检测的手段应用不广泛,给临床工作中的真菌感染诊断带来很大问题。此次新冠疫情之前,国内很多医院对呼吸道病毒的检测能力较弱,常常应用的是抗原快检,甚至价值不大的抗体诊断的方法。但我们也欣喜地看到,疫情发生以后,在国家的强烈推动下,国内很多二级医院都建成了自己的分子生物学实验室,这能使我们更多感染病原的诊断通过分子生物学鉴定成为了可能。

 

 

分子生物学的临床应用,非常需要的是快速多重分子生物学的检测方法,实现「样本进报告出」的检测模式,这方面国际做的比较好的包括FilmArray、Xpert等平台。疫情期间,我们也看到一些国产的POCT分子生物学快速检测平台,已经慢慢应用到临床工作中,特别是新冠检测的领域。此外,包括用于二代测序的平台都已被广大医务人员所熟知。

 


从表中可以看到,分子生物学检测的手段多种多样。为了满足不同的临床目的,临床医生需要对这些手段有更多认识,才能针对不同病原、不同患者的情况,选择更适合的检测方式。

 


上图所展示的是目前分子生物学检测的手段,虽然没有列出国内的,但最近几年国内快检的分子检测手段也应用得越来越多。



进口的Xpert平台,在国内主要用于结核分枝杆菌,以及利福平耐药的检测,但实际上在一些病毒检测中它也有独到之处,如该平台有甲、乙流和呼吸道合胞病毒的联合检测手段。COVID-19期间他们也研发出的SARS-CoV-2检测手段,只是目前在国内还没有上市。但这样的手段对临床高度怀疑的患者提供了非常必要的快检方法,可以在30分钟内完成检测。

 


上图是梅立埃的Filmarray多重PCR的检测平台,在国内目前还没有应用。其呼吸道试剂盒可以检测大多数呼吸道病毒,同时包括常见的细菌感染,甚至包括一些重要耐药基因,如:金黄色葡萄球菌的mecA基因,碳青霉烯耐药(KPC、NDM、OXA-48等)等。所以,对于重症患者而言,可能更需要在一两个小时内拿到检测结果,及时指导临床用药,类似的POCT快速多重PCR检测平台具有重要价值。患者是病毒感染还是细菌感染,或者可排除此类感染?这样的检测设备或检测理念非常重要。


这是病毒性肺炎主要的病原谱,可以看到,这些病原谱实际上非常适合多重PCR的靶点设计。

 

今年较少检出甲、乙流感病毒,因此推测防护新冠病毒的生活方式对于防护其它呼吸道病原非常有帮助



对于甲流和乙流的检测,以往每年一到秋冬季节,就意味着已经进入了流感季,但今年也许有疫情的原因,口罩等日常防护实际上对防护流感病毒或其它呼吸道病原的感染起到了非常关键的作用。往年实验室在这个季节检测出甲流、乙流以及呼吸道合胞病毒、肺炎支原体的机会很多,但今年从我们实验室的情况来看,几乎很少检测到。因此,可以推测,用防护新冠病毒的生活方式,对于防护其它呼吸道病原也非常有帮助。

 


我们为什么提倡流感病毒的快速检测,希望在短的时间拿到准确的结果?因为抗病毒药物的使用与它的时限相关,如果在症状出现48小时内确诊,给予抗病毒治疗,患者受益非常大。

 


呼吸道合胞病毒(RSV),过去的概念认为它对于儿童或老年人意义更大,但现在发现,其他一些免疫能力低下的患者,也有可能是呼吸道合胞病毒的感染,如果同时合并其他病毒或非典型病原体感染,患者预后较差。目前对于RSV的实验室诊断手段并不是很多,主要靠分子生物学检测。也有一种快速的抗原检测(胶体金检测)方法,操作简单、易于培训、报告结果快速,但是灵敏度相对较差。

 


冠状病毒,目前共有7种可致病。MERS病毒和2003年底出现的SARS病毒也是冠状病毒中非常重要的一类,特别是今年的COVLD-19,至今都还没有完全得到控制。其它4种冠状病毒,主要引起人的感冒,但在免疫力低下人群,也可以引起患者重症感染,甚至死亡。因此,采用分子生物学的手段去明确高危人群是否感染,再采取强有力的防控和治疗措施,非常重要。

 

mNGS、WGS和TNGS的概念较易混淆,但掌握几点核心就可分清……质谱的弱点是不能对样本进行检测



mNGS检测,首先mNGS、WGS和TNGS这几个概念比较容易混淆,但我们只要知道,mNGS主要针对样本,样本送检后直接进行mNGS检测,而且这种检测无偏移(unbias),不预设目标,可检测到样本中所有病原微生物;而TNGS即有靶向的测序,可以检测其中的细菌,或者看它分布的情况,可以用16S rRNA对细菌进行扩增,再进行相关测序,与mNGS成本较低,其灵敏度较高,缺点是会遗漏真菌、寄生虫、病毒等微生物;WGS主要应用于已分离出来的纯菌落的基因组检测。

 

有的老师会问,用于微生物检测的飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是不是更快速一些?实际上MALDI-TOF MS也有自己的弱点,目前主要对分离出来的纯菌落进行菌种鉴定,一般不能对样本进行检测,除非样本中含有数量较多的单一菌,如血培养瓶报阳以后采用MALDI-TOF MS对生长的病原菌进行菌种鉴定。

 


不同厂家之间的mNGS结果差异性非常大的原因是什么?上图为目前mNGS的流程。mNGS有些关键的环节非常重要,首先是核酸的提取,但在之前采集一份合格的样本更重要。必须要注意,不管检测手段多么先进,检测只能告诉我们样本中某种病原存在的情况,如果采集的样本里不含有相关病原,即使技术再高也只能得到「南辕北辙」的结果。因此,我们首先强调的一定是采集合格的样本,只有合适的反映感染部位感染情况的样本才能进入核酸提取的过程。如果只考虑DNA病原感染,仅做DNA测序即可。如不能排除RNA病毒,或者想在转录水平上看微生物的情况,需要有反转录的过程将RNA转化成cDNA。然后进行文库构建,二代测序通常要将上一步提取的基因组打断成比较均一的50~150bp的长度,开始测序。

 

测序结束后,因为样本里大多数都是人源宿主的DNA(含量多少与样本类型有关),有的公司在测序之前去除人源宿主的细胞,有的是在测序后的生物信息处理这一步骤去除人源宿主的序列,总体来说这样的方式差别非常大。即便我们拿到了测序结果,进行数据库比对,不同公司之间的数据库也不一样。构建的数据库是否全面直接决定了报告的质量。


此外,不同公司测序时,为了节约成本,测序深度不够,灵敏度较低。这也导致很多文献报告mNGS的结果优于传统方法,但临床工作发现远非如此的原因。


不同厂家检测的结果受到这些关键环节的影响。

 

病原细胞壁厚度直接决定提取核酸的能力……用血液制品、尤其用血浆进行基因组检测时应注意一个关键点

 


这是一个患者的脑脊液检测,用的是mNGS检测方法。报告显示,有一些弓形虫,还有一些隐球菌、曲霉菌等。我们一定要知道,不同的病原,它的细胞壁的厚度是不一样的,这直接决定了成功提取核酸的差异。mNGS在核酸提取的过程中,如果有很多破壁困难的微生物,包括分枝杆菌,主要是TB/NTM,诺卡菌,真菌中曲霉菌、毛霉菌、隐球菌、双相相菌等,破壁都比较困难。即使上述病原在原始样本中有数量比较多,如果破壁技术达不到要求,里面的DNA也无法提取出来,或者提取数量不足,导致检测出序列数很低。所以,即使检出的序列数较低,也要高度怀疑因为破壁存在的困难导致,要采取其它的方法进行相关验证。


绝不能在审读mNGS报告时,认为reads多的微生物就是致病菌。


 

普通的冠状病毒会引起类似感冒的症状,在某些患者中的症状也可以非常重,甚至会导致死亡。这些临床案例有很多,但都说明实际上我们对于冠状病毒的认识可能并不特别深刻,还要进一步加强认识。如果一旦检出来的病毒非常具有流行病学意义,就说明非常危险,可能需要立即启动应急程序。

 


当患者为血流感染时,目前常血浆进行基因组检测时,检测的主要是游离DNA(cell-free DNA,cfDNA),在人体其它部位感染或者定植的微生物,有一部分可以将降解的cf DNA释放入血。所以,我们在解读血液样本的mNGS结果时一定要注意,里面有可能是一些比如口腔链球菌、唾液链球菌等,如果是这些存在,并不意味它一定是病原体,可能只是一些裂解的核酸,需要与临床结合,不能将检测核酸与感染的病原微生物划等号,这是非常关键的。

 

以上简要介绍了目前临床微生物检测的分子生物学手段的情况。结论有三:

 

1、POCT的多重快速PCR检测是未来发展的重要方向;

2、mNGS会成为改变临床微生物诊断方法的技术手段;
3、应重视样本采集环节,标本质量是检验质量的基础,遵循呼吸道感染微生物采集标本要求,控制样本质量。


专家介绍

鲁炳怀

中日友好医院呼吸与危重症科二部临床微生物与感染实验室,主任医师,副教授,医学博士,硕士生导师。中华医学会检验分会微生物学组委员,中华医学会热带病与寄生虫分会青年学组委员,中国微生物学会医学微生物学与免疫学专委会真菌学组常委委员,华人药敏试验委员会委员,北京医学检验学会理事。



本文完

排版:Jerry


本文由《呼吸界》编辑 冬雪凝 整理,感谢鲁炳怀老师的审阅修改!


来自: 呼吸界 | 作者:鲁炳怀
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