间接免疫荧光法检测细菌的实验方法和注意事项

间接免疫荧光染色法是利用抗球蛋白实验的原理，以荧光素标记抗球蛋白抗体，鉴定未知抗原或抗体。染色程序分为两步：第一步，用已知抗体加到未知抗原上，作用一定时间后，水洗。第二步，加上荧光素标记的抗球蛋白抗体，如果第一步中的抗原抗体相对应，互相发生了反应，则抗体被固定，并与荧光素标记的抗球蛋白抗体结合，发出荧光。

间接免疫荧光染色法的优点是：既能检查未知抗原，也能检查未知抗体；用一种标记的抗球蛋白抗体，就能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知护抗原或抗体；另外，本法的敏感性较高，通常比直接染色法高5-10倍。

缺点是：由于参与反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，因此结果判定有时较难；另外操作方法比较繁琐，需要做的对照较多，时间也较长。

一、试剂与仪器

（1）磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

（2）荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释

（3）缓冲甘油：9份分析纯无荧光的甘油+1份PBS配制

（4）荧光显微镜

（5）玻片架

（6）滤纸

（7）37°C温箱等。

二、实验方法

1、标本制备

（1）涂片标本方法：先将载玻片通过火焰3次，冷却后，以接种环（或铂金耳）挑选被检材料均匀涂布成直径约1cm的圆形涂片。如材料太浓，则应预先加适量灭菌生理盐水于另一玻片上，用接种环挑取材料与其混合稀释，待均匀后涂片，也可将生理盐水加入被检材料中，混合均匀后涂片。涂好后，自然晾干。

（2）压印标本方法：用无菌剪子将待检组织标本剪开，用无菌清洁棉球或滤纸将切面的血液吸干，然后以载玻片轻压切面，使之沾上1-2层细胞，然后再在玻片另一处以切面涂拭，得一较厚抹片，将标本自然晾干。

2、标本固定：被检标本的固定是免疫荧光技术中的重要环节，往往对荧光染色效果有明显的影响。除了研究细胞表面抗原可不固定外，一般均应先固定，然后再进行荧光抗体染色。细菌免疫荧光常用的固定剂有丙酮、10%甲醛或甲醇，固定条件为室温3-10min或4°C 30-60min。

3、将固定好的玻片标本置于湿盒中，吸取经适当稀释的免疫血清加于标本上，于37°C作用30min。

4、取出载玻片，先以PBS冲去未结合的标记抗体液，然后置大量PBS中漂洗15min，或使用去离子水或蒸馏水缓缓冲洗玻片多次后甩干，然后浸泡于PBS中1min。

5、取出载玻片，用吸水低吸干余留的液体。

6、滴加相应的抗球蛋白荧光抗体，将玻片置于带盖的不透光容器内（底部垫以滤纸，纸上放玻片架，加适量水使滤纸浸湿，玻片数量少时可用平皿，内置2-3个浸湿的棉球），密盖，放置于37°C染色30min（温度和时间根据标本情况而定）。

7、取出玻片，置玻片架上，先以PBS冲去未结合的标记抗体液，然后置大量PBS中漂洗15min，或直接在中性或偏碱性的自来水下冲洗5min，然后浸泡于PBS中1min。

8、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，保持标本湿润，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖封片后置荧光显微镜检查。

三、结果记录

观察标本的特异性荧光强度，荧光强度用以下符号表示：

-：无荧光；

±：极弱的可疑荧光；

+：荧光较弱，但清楚可见；

++：荧光明显，呈黄绿色；

+++：荧光明亮，呈明显的绿色；

++++：荧光闪亮，呈耀眼的亮绿色。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

四、注意事项

1、应设立对照实验，以排除非特异性荧光。

2、用荧光显微镜检查标本时，每次检查时间以1h为宜，超过1.5h，高压汞灯的亮度会逐渐下降，荧光减弱。此外，标本受紫外线照射15min后，荧光明显减弱，可能是荧光色素与抗体发生暂时解离所致，所以最多不得超过2-3h。

3、荧光显微镜的光源寿命有限，通常只有200h，反复开闭更能影响其寿命，帮标本应集中检查，节省时间，保护光源。灯熄后再用时，须待灯光冷却后才能再开。

4、标本染色后应立即观察，放置时间过长，荧光会逐渐减弱，若将标本放在4°C 保存，可延长荧光时间。