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我国临床微生物实验室现状与分级诊疗下实验室的能力建设重点 ... ...

归去来兮 2020-10-27 76人围观 机构


作者:胡继红1  丛玉隆2
单位:1.国家卫生健康委临床检验中心,2.解放军总医院临床检验中心


面对“十三五”医改规划中提出的今年基本建立符合国情的分级诊疗制度,并对三级医院和二级医院的诊疗方向做了定位;今年初百年一遇的全球爆发的新冠病毒重大传染病疫情也带给我们极大考验和反思。本文通过对参加全国质评活动的微生物室所做的问卷调查,面对我国临床微生物实验室的基本现状,确定各级医院实验室建设的目标、实验室能力如何满足其所在医院对感染性疾病的诊疗需求,参考国际相关法规,对现阶段我国不同等级医院的临床微生物室能力分级进行了初步论述。


一、目前形势和我们的任务


近年来,我国卫生管理部门对临床微生物学实验室的建设在不同时期提出了要求,促进了学科的进步和发展。2011年卫生部关于二级以上医院设置感染性疾病科和临床微生物室,配备感染专业医师、微生物检验专业技术人员和临床药师,对临床科室抗菌药物临床应用进行技术指导,加强临床微生物标本检测和细菌耐药监测。《抗菌药物临床应用管理办法》卫生部第84号令再次强调:二级以上医院应建立临床微生物室,开展微生物培养、分离、鉴定和药物敏感试验等工作,提供病原学诊断和细菌耐药技术支持,参与抗菌药物临床应用管理工作。


《“十三五”深化医药卫生体制改革规划》指出,2020年基本建立符合国情的分级诊疗制度。二级医院以常见病、多发病的诊断和鉴别诊断为重点;加强县级公立医院综合能力建设和学科建设,重点在常见病、多发病相关专业科室以及紧缺专业临床专科建设,逐步降低县域外就诊率。引导三级公立医院参与分级诊疗:收治疑难复杂和危急重症患者,逐步下转常见病、多发病和疾病稳定期、恢复期患者。


近十年来,我国医疗机构发展非常迅速,三级公立医院数量几乎翻倍,2020年初已达2762家,二级医院达9730家。国家卫健委宣布,2020年县医院要达到三级,500家县医院(包括部分贫困县县医院)和县中医医院要分别达到“三级医院”和“三级中医医院”服务能力要求。


面对国家医改大局,如何满足所在等级医院对感染性疾病诊断和治疗的需求,如何满足应对突发重大传染病的病原学诊断要求,是摆在我们临床微生物检验工作者面前的重大课题和挑战!


二、临床微生物室的作用及特点


随着医疗技术的不断进步,器官移植技术、各种介入性操作手段在临床的应用、抗菌药物的广泛使用造成各种耐药菌的传播,新发和再发感染性疾病的不断涌现,随着人群流动的频繁,原来局限的感染性疾病得以迅速播散,尤其是高致病性病原微生物对人类危害极大。临床微生物实验室在感染性疾病的诊断、治疗中处在“前哨”的位置。病原学诊断是感染性疾病诊断的金标准,只有确定了病原菌和药敏结果,临床医生才能真正做到选择正确的抗菌药物和合理用药。


1. 临床微生物学实验室的主要作用:对感染性疾病作病原学诊断,提供药物敏感性试验结果,提供临床个体化治疗和用药依据;监测医院内感染的暴发,追溯传染源及其播散途径;监测病原菌的获得性耐药,指导临床经验性用药和监控抗菌药物的过度使用;参与疑难感染性疾病的会诊和医院的抗菌药物管理工作等。


2. 临床微生物学检验的主要特点:(1)标本来源遍布全身各部位;(2)标本类型多样:液体、固体、半固体、植入体等;(3)分析前影响因素多,标本前处理、标本合格判断难度大;(4)病原体是未知的,有内源性感染和外源性感染;(5)病原体种类涵盖了微生物八大类:细菌、放线菌、真菌、支原体、衣原体、病毒、立克次体和螺旋体;(6)对技术人员的技能要求高:检验环节多,手工操作多,特别需要经验、专业基础知识及不断的知识更新;(7)不断出现的新病原、耐药菌变异;(8)需要综合运用传统微生物学技术、基于培养的蛋白组学、非培养技术包括核酸检测、免疫学等多种技术和方法;(9)需要有丰富专业经验的人员判断检验结果与感染是否相关;(10)与临床医生持续良好的沟通合作等。


三、美国临床微生物室的检测能力分级


美国CLIA’88法规中的能力测试(Proficiency Testing Programs,PTP),将临床微生物学(Clinical Microbiology)专业实验室分为5种亚专业实验室,每种亚专业有相应的能力等级划分,如规定细菌学分5级、分枝杆菌学(含结核分枝杆菌)分5级,真菌学分4级,病毒学分2级,还包括寄生虫学。各亚专业能力水平从低水平操作标本的镜检形态学解释结果、直接抗原技术检测某种病原体;标本接种培养后外送做鉴定和药敏试验;处理不同来源标本,从简单(尿、咽拭子、生殖道拭子、便等)到复杂类型(血液、脑脊液、组织、无菌体液、脓液等);掌握不同病原菌的培养技术和方法的难易程度;从不同来源的标本分离的常见菌、少见菌、特殊菌能鉴定的属或种水平;可做常见病原菌的商品化药敏试验,到特殊菌的特殊药敏试验等诸方面,按操作的复杂程度,检测能力由低到高进行界定分级。并不是对实验室的能力一概要求,能力不足的就外送检验。是高大上还是小而全,要做卫生经济学评估,用最低的资源投入得到尽可能高的回报。


四、临床微生物实验室基本信息调查


1. 微生物实验室数量及大小:今年9月,国家卫生健康委临床检验中心对参加全国临床微生物室间质评活动(高级)项目的实验室做了调查,2048家完成了问卷。其中所在三级医院实验室1657家,占80.9%,包括三级甲等医院占64.67%(含三级特等6家),三级乙等医院占15.28%,三级丙等医院1.46%;所在二级医院占10.35%,其中二甲医院占9.67%;第三方实验室占8.74%;通过ISO15189医学实验室认可的实验室395家(19.29%);参加全国细菌耐药监测网的实验室1168家(57.03%),参加省级细菌耐药监测网的实验室1366家(66.7%)。


2. 按行政划分医院实验室:来自省级医院微生物室占19.37%,市级占38.64%,地市级、县级和区级分别占14.27%、11.72%和11.57%,90家无行政级别。


3. 微生物室总面积:小于60平米占28.47%,60-160平米占58.86%,大于160平米只占12.66%。马筱玲等《临床微生物学实验室建设基本要求专家共识》(以下简称“共识”)建议,三级、二级医院微生物室面积分别不低于160平米和60平米。


调查数据主要反映了三级医院微生物室的现状,参加高级质评项目的198家来自二级甲等医院微生物室,其能力基本上可以代表二甲医院微生物检验最好水平。


4. 微生物实验室人员:共识要求微生物室固定人员:二级医院至少3人,负责人至少是中级职称;三级医院至少6人,至少是副高职称。本次问卷调查显示:微生物实验室固定人员1-3人的占41%,5人以下的占77.24%,6人以上的只占22.51%,见图1。目前微生物室高级职称人数:无高级职称479个(24%),有高级职称:1人/947个,2人/352个,3人/138人,4人以上/131个,职称人数分布百分率见图2。80%三级医院为主的调查,临床微生物室高级专业人才匮乏,整体行业人员明显不足。



5. 基本设备情况:共识要求的二级、三级医院微生物实验室必备的基础设备的占有率:II级生物安全柜占99.5%,高压消毒灭菌器占96.92%;3台以上孵箱占71.29%,CO2孵箱占91.89%;2-8℃冰箱占90.17%,-20℃冰箱占83.25%,-40℃冰箱占18.31%,光学显微镜占98.58%,普通离心机占87.16%。三级医院微生物室必备的用于无菌体液形态学检验的细胞离心机25.14%;浊度仪88.96%,-80℃冰箱占66.60%;有条件的三级医院微生物室配备的设备:自动染片机33.54%,标本自动接种仪9.03%,飞行质谱仪30.22%,荧光定量PCR仪20.8%,测序仪2.0%,5.66%的实验室无以上设备。


以上数据显示,临床微生物室很多基本设备的拥有率偏低,有些甚至非常低,病原体检测的技术平台建设有待进一步加强。在专业技术人员严重匮乏的状况下,自动化程度如自动染片机、标本自动接种仪的分析前处理相关的配置严重不足,与微生物室投入产出比低有很大关系。当然,自动化程度与临床送检的标本量成正比,送检的标本量少,不良的循环导致很难发展。现状是二级医院微生物室通常1个技术人员,有的甚至还要兼科里的值班和其他室轮转,很多实验室往往一天只有不到10个标本。


五、临床微生物实验室的基本技术


临床微生物实验室应用的基本技术包括显微镜检验、微生物分离培养、鉴定、药敏试验、菌株的血清学分型等。这些技术不会因为技术的发展和进步而遭淘汰,其作用不能被分子生物学、免疫学技术和方法完全替代,是临床微生物室应对感染性疾病的基本和重要能力的体现。


(一)常用染色技术和方法


显微镜检测技术是临床微生物检验的最基本技术,也是实验室人员的基本功,需要长期的实践经验的累积,微生物检验中成本最低、速度最快的就是镜检方法。


1. 不染色标本显微镜检验:湿片是不染色标本最常用方法,如对阴道分泌物直接观察假菌丝和孢子,诊断念珠菌性阴道炎;10%KOH湿片快速观察组织和体液中的真菌,如皮肤、指甲、活检材料和痰。


暗视野镜检适合对活细胞作不染色标本的显微观察。如肠道门诊开设的暗视野显微镜观察呈穿梭状动力筛查霍乱弧菌,并用特异性血清凝集做制动试验;观察特殊运动方式的密螺旋体,结合临床症状,即可初步判断为梅毒螺旋体。负染色方法如脑脊液墨汁染色用于检查新生隐球菌,当离心沉淀的脑脊液中发现有荚膜的酵母菌提示新生隐球菌,是诊断隐球菌性脑膜炎的常规方法。


2. 鉴别染色方法:临床微生物室最常使用的鉴别染色方法有革兰染色、抗酸染色等,革兰染色结果解释包括染色特征和形态,用于细菌的形态学分类,还可用于临床标本的染色,包括识别宿主细胞类型和吞噬细胞。如痰涂片可见大量鳞状上皮细胞,表明标本被上呼吸道定植菌污染;根据白细胞的数量、存在肺泡巨噬细胞和柱状上皮细胞,可提示是合格的深部痰;在白细胞周围大量单一形态的细菌,与培养结果相对照,可提高培养方法的特异性及敏感性。白细胞内发现细菌提示活动性感染,如男性泌尿道脓性分泌物标本,在白细胞内找到革兰阴性双球菌可诊断淋病;阴道分泌物经革兰染色镜检,找到线索细胞提示细菌性阴道炎。


深部组织、分泌物培养时都应同时做革兰染色;脑脊液和无菌体液染色前需用细胞离心机甩片处理,将细胞与细菌分层以提高革兰染色的敏感性,缩短了TAT时间。血培养阳性标本、脑脊液标本直接涂片革兰染色,作为危急值一级报告,可尽早提供临床用药调整依据。


我国是肺结核高负担国家,抗击结核病任务艰巨。抗酸染色用于筛查致病性分枝杆菌的常规方法,但敏感性较低,金胺O或金胺-罗丹明染色可提高检出抗酸杆菌的敏感性,但需要用荧光显微镜观察。除分枝杆菌外,奴卡菌、马红球菌、军团菌(L.micdader)等,需用弱抗酸染色法。Giemsa染色法可观察细胞内结构,用于检测骨髓组织标本和白细胞中的可疑荚膜组织胞浆菌。


3. 荧光染色:常见有荧光增白剂染色,直接检测脑脊液和其他体液的真菌,荧光染料与真菌和酵母菌的细胞壁结合,酵母菌和真菌显示白色荧光,但细菌和炎症细胞不被染色。


免疫荧光染色使用特异性抗体结合标本中的目标抗原,抗原-抗体复合物通过附着的荧光染料可被检测,有直接荧光抗体(DFA)和非直接荧光抗体试验(IFAT)。六胺银染色镜检是诊断引起艾滋病和其他免疫缺陷患者肺部感染的耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci,PCP)的常规方法,因PCP在普通的培养基上不生长,理想的标本类型是肺泡灌洗液(BAL)、诱导痰或肺组织。


4. 实验室开展常用染色方法的调查:本次问卷调查实验室开展常用染色方法如下:(1)开展最基本革兰染色方法的实验室占99.36%,本次调查未深入了解实验室是否对下呼吸道标本、无菌体液和脓等标本做常规涂片检验,根据平时的了解,如果临床不开镜检申请很多实验室不做检测,检验的质量将大打折扣,可通过医院的信息系统设定解决,实验室人员严重不足,给涂片镜检带来很大困难;(2)开展抗酸染色占95.90%,金胺O(金胺-罗丹明)荧光染色的仅有7.47%,此方法可提高分枝杆菌阳性检出率十个百分点,有荧光显微镜的实验室占34.08%,但开展荧光染色的实验室比例更低;(3)开展检测脑脊液隐球菌的墨汁染色方法的实验室86.18%;(4)开展丝状真菌的形态学检测方法:棉兰染色法和10%KOH法分别为54.98%和50.58%。此外,共识建议的三级医院必开展荧光染色法的实验室仅占22.51%,检测耶氏肺孢子菌的六胺银染色占13.72%。


(二)临床微生物实验室分离培养技术


培养仍然是病原学诊断的金标准。尽管100多年来诊断微生物学有了长足的发展,但在任何临床微生物学实验室,培养和分离技术在诊断大多数细菌和真菌感染方面一直占据着核心地位。实验室可处理标本的复杂程度、培养病原菌的难易程度是代表实验室能力的一个重要方面。引起人体感染的微生物有外源性和内源性,口腔、肠道、生殖道、皮肤等是人体的天然菌库,当这些部位的正常菌群易位到无菌部位,特别是来源于身体各部位的无菌体液、深部组织、深部脓液,往往有需氧菌和厌氧菌的混合感染,属于高度复杂感染的检验,感染病原学诊断的特异性也高。


在微生物培养中对营养苛求高的细菌被称作“苛养菌”,生长需要5-10%CO2环境,因此,微生物室必须配备CO2培养箱。根据微生物生长对气体的不同需求,分需氧培养、微需氧培养和厌氧培养。厌氧菌培养要求低氧化还原电势和特殊营养的培养基和无氧环境;微需氧菌包括弯曲菌、螺杆菌属等,其理想气体环境是混合气体中含5%O2、10%CO2和85%N2,培养需配置充气换气设备或采用商品化气体发生袋和密封罐装置。厌氧菌的革兰染色形态特异,如果这些特殊形态的细菌在需氧培养时不生长,可报告临床可疑厌氧菌感染,对医生的经验性治疗仍有较大帮助。实验室培养和分离病原细菌的能力与是否掌握以上的培养技术和配套设施密切相关,是微生物室核心能力。


本次问卷调查显示,有以下分离培养方法的实验室占比分别是:常见需氧菌94.58%,苛养菌84.03%,少见菌(包括棒状杆菌、奴卡菌、放线菌等)22.12%,分枝杆菌34.71%,厌氧菌60.64%,微需氧菌59.76%,酵母样真菌96.63%,丝状真菌68.06%。少见菌和分枝杆菌的分离培养率较低。


(三)基于培养的鉴定技术和药敏方法


1. 全自动血培养仪:血培养方法仍然只能是诊断细菌血症和真菌血症的金标准。细菌血症和真菌血症的实验室检测始终是临床微生物室中最重要和复杂的角色之一,其导致的死亡率高达12%。菌血症的诊断需要从患者不同采血部位进行多次血培养,患者血液中的病原菌的数量少到甚至分子方法都检测不到,还不及培养方法敏感,血液中某些蛋白质和其他成分也抑制某些核酸扩增,并且在非菌血症患者体内误测到核酸可造成假阳性结果。本次问卷调查显示,三款国际主流品牌全自动进口血培养系统占86.62%,四款国产全自动血培养系统占15.92%。随着医院越来越重视菌血症的诊断,血培养送检的标本量逐年增加,很多三级甲等医院有几套血培养仪。新一代自动上样的血培养系统的上市,更适合放置急诊、重症病房等区域,抽血后送至仪器平台,可自动扫描条码上样培养,单就这项进步已极大缩短了报告阳性血培养的时间,为挽救患者生命赢得了宝贵的时间。


2. 基于培养物的鉴定系统:传统上,细菌和真菌的鉴定是基于常规生化管的反应,临床需要便捷的手工试剂盒和半自动检测鉴定系统提升标准化。80年代中期出现的自动鉴定药敏系统依靠微生物的生化特性、脂肪酸构成和其他代谢特性来鉴定,不同系统的菌种数据库可鉴定的细菌、酵母样真菌的种类和数量不同,用于临床实验室鉴定的系统菌库通常在300-800余种,自动化系统鉴定时间通常在16-24小时,非自动化鉴定系统培养时间4-48小时不等。


近年来推出的依赖于蛋白质组学技术的基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱(MALDI-TOF MS),提供了快速且廉价的细菌和真菌鉴定系统,可在几分钟之内完成对微生物的鉴定。组合的以核糖体蛋白质为主的谱峰型,经计算机软件将检测的质谱与参考谱数据库比对,根据匹配相似度的高低鉴定微生物的科、属种和亚种水平,现在的数据库可鉴定300多属2000余种的菌种,并且还在不断扩展,比自动化鉴定系统扩展了对分枝杆菌、奴卡菌等放线菌、丝状真菌等类别菌的鉴定,质谱技术应用于对临床微生物的鉴定方法是划时代的革新。


本次问卷调查显示,有全自动鉴定药敏系统的实验室占84.66%,与调查的三级医院实验室占比相当,三甲医院可达90%,二甲医院可达到78%;进口半自动鉴定药敏系统占18.16%,国产半自动鉴定药敏系统占21.73%,在三级、二级医院实验室均有分布。有些三甲医院微生物室拥有不止一种品牌的自动化鉴定仪,无自动鉴定系统的实验室有50家。


进口MALDI-TOF时间飞行质谱仪在我国与国际同时期上市,目前进口质谱仪实验室占有率在79.54%,国产质谱占有率20.43%,进口质谱仪占八成。作为补充鉴定的手工商品化试剂,当系统在鉴别遗传特征相近的微生物时,不能鉴定到准确的种水平,需要用到部分手工试剂。本次问卷调查显示,鉴定化脓链球菌杆菌肽纸片58.05%,厌氧菌分类纸片5.08%,检测产β-内酰胺酶的头孢硝噻吩纸片46.63%,鉴别肺炎链球菌的奥普托欣纸片78.59%,鉴别流感嗜血杆菌的X&V因子纸片40.97%,无以上试剂的实验室占14.79%。当质谱仪、自动鉴定系统不能给出准确结果时,这些试验是重要的鉴别手段。


3.药敏方法与药敏标准:临床微生物实验室的主要功能之一是对有临床意义的细菌分离株做药物敏感试验,预测所检药物的治疗效果,提供临床个体化的精准治疗。药敏方法有参考方法,如微量肉汤稀释法,可准确检测最小抑菌浓度MIC值,是其他药敏方法的对照方法,需要严格的质量控制和熟练精确的手工操作,不适合一般实验室的常规使用。临床常规适用的药敏方法有:1)纸片扩散法:定性药敏试验,只给出敏感性结果,可自主灵活选择药物,不受新药和标准改变折点的影响,成本低,但不适用大部分苛养菌和少见菌及特殊标本来源的细菌/药物;2)自动仪器法:定量药敏试验,可检测MIC值,全自动药敏仪的专家软件系统对耐药表型结果分析并报告。只适用于常见需氧细菌和少数苛养菌,当药敏折点变化时,仪器的标准更新滞后,实验室应关注软件版本的

及时升级;3)梯度扩散法:用于检测苛养菌、少见菌和厌氧菌等药敏试验,操作方法类似纸片扩散法,可读取MIC值,与参考方法的结果一致率良好,是微量肉汤稀释法的常规替代方法,但价格成本高。实验室应具备至少常规检测的药敏方法,日常三种方法互补,在基本层面满足临床的个体化治疗需求。


全球最主要的两个药敏标准折点设立机构是美国临床和实验室标准化研究院(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)和欧洲抗微生物药物敏感试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)。EUCAST与CLSI的药敏方法学和折点有些不同,随着折点设立方法的国际标准化,两个机构颁布的折点会更加趋于统一。药敏标准每年都有更新,微生物实验室应在年初即关注新标准的变化。目前,国内主要参照CLSI的药敏标准解释结果,EUCAST药敏方法和折点也越来越多的被关注和参考,我国不久前成立了EUCAST在中国的药敏分委会(CHiCAST),为建立我国的药敏折点和走向国际迈出了重要一步。CLSI建立的不同类型细菌和真菌的药敏试验方法和解释折点最多,已颁布的部分药敏标准或指南中(1)需氧菌的药敏方法最成熟,有纸片法和MIC法结果解释,适合常规实验室检测执行;(2)苛养菌和少见菌、厌氧菌药敏试验指南要求做MIC法,仪器不能检测,对实验室能力要求比较高,首先要有能力分离鉴定这些菌,当经验性治疗效果不好、临床要求检测时才做;(3)非结核分枝杆菌、奴卡菌及需氧放线菌药敏试验没有商品化试剂,CLSI推荐微量肉汤稀释法,不是实验室的常规药敏方法;(4)酵母样真菌药敏试验常规用商品化试剂盒;(5)侵袭性丝状真菌通常在临床需要时才做药敏试验,能开展的实验室不多。结核分枝杆菌商品化液体药敏试验因在封闭的含药物的培养瓶中自动观察生长,可在综合医院开展,其他药敏方法在结核病专科医院开展,需要做特殊的生物安全防护。


当前,临床微生物室的药敏表型检测已经进入了表型结合耐药基因型检测的时代。随着分子技术越来越普及,特别是全基因组测序,开启了实验室诊断从表型药敏试验到基因型预测耐药重要转变的可能性。大型实验室有能力检测一些重要的耐药基因,检测mecA基因筛查苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)、检测肠球菌属的vanA和vanB基因筛查万古霉素耐药的肠球菌等,这些分子检测对于感染控制的价值正不断增加。分子方法的价值还体现在确认异常耐药和检测具有流行病学意义的耐药机制。如分离自严重感染的某些种葡萄球菌的MIC折点可能高估其耐药性,当MIC值在一个特定范围时,需要检测mecA基因来确认是否是苯唑西林耐药。耐药基因的分子检测将逐渐成为微生物室的常规试验。


本次问卷调查显示,能开展各种病原菌药敏试验的实验室占比为:(1)用自动仪器法或手工法商品试剂盒:需氧菌药敏试验95.41%,苛养菌药敏试验76.17%,酵母样真菌药敏试验82.18%,这与三级医院的比例接近;生殖道支原体鉴定药敏一体试剂盒55.91%;(2)用梯度扩散法:厌氧菌药敏试验22.21%,丝状真菌药敏试验21.24%,分枝杆菌药敏试验14.35%,放线菌药敏试验12.5%,微需氧菌药敏试验11.57%。用梯度扩散法的药敏试验开展率偏低,临床更多是经验重要,治疗效果不好才考虑做药敏;此外,梯度扩散法的试剂条价格很高,每个药都要单独注册,获得CFDA注册的药物不多,这也是实验室面临的瓶颈。


4.检测细菌耐药性的特殊表型方法:CLSI推荐了很多临床重要的细菌耐药性的特殊表型检测方法,目前热点之一是检测产碳青霉烯酶的肠杆菌和铜绿假单胞菌,碳青霉烯酶类抗生素是广谱β-内酰胺类药物,治疗严重感染和多重耐药菌引起的感染,被视为“最后一道防线”,碳青霉烯酶类耐药是一个严重的临床和公共卫生问题。CLSI推荐手工法检测产碳青霉烯酶的方法有CarbaNP试验、mCIM、mCIM联合eCIM和其他分子检测方法。


此次问卷调查显示,目前能开展以上CLSI推荐的几种方法的实验室不超过200家,有84家实验室采用商品化胶体金法的Carba5试剂盒,一次可检测5种碳青霉烯酶(KPC-、NDM-、VIM-和IMP-型和OXA-48-like),操作简单,结果也较准确,上市后将有助于实验室提升快速检测产碳青霉烯酶的肠杆菌和铜绿假单胞菌。


(四)开展感染性疾病诊断的非培养技术


以培养为基础的方法一直是感染性疾病诊断的“金标准”,随着分子生物学方法的发展,对于肠道病毒性脑炎、百日咳、HSV脑炎、沙眼衣原体和淋病奈瑟菌引起的生殖道感染等都将核酸为基础的检测作为感染性疾病诊断的“金标准”。对结核病等其他疾病,核酸扩增检测起到对培养方法很好的辅助作用,可提供更快的初始诊断和及时的公共卫生干预措施。


诊断分子微生物学方法补充了培养方法对于无法培养或难培养、生长缓慢,或在运输过程容易死亡的、在标本中含量低的以及在培养中容易被定植菌覆盖的病原微生物的检测。国家药品监督管理局批准的核酸扩增、自动化和多重扩增技术方法,特别是将样品制备、扩增与检测完全整合的定量PCR系统,即通常所说的“样本进,结果出”的一体化POCT式分子检测系统,特别适合临床微生物室的应用,对感染性疾病患者的个体化即来即测,可成为微生物室对临床的常规分子检测项目。


将传统方法和分子检测技术的优势结合应用是临床微生物室的优势,当标本中的病原菌含量低于核酸扩增检测的检出限,或受标本中的干扰物影响得到假阴性结果,核酸扩展前如能结合传统的短时间选择性培养增菌培养,可提升核酸扩增检测的敏感性,如肠道门诊对霍乱弧菌的筛查,选择性肉汤增菌培养后,即可对培养物转种做生化和血清学分型鉴定,对于O1群或O139群霍乱弧菌,还需经PCR检测是否产霍乱毒素,如产霍乱毒素才有流行病学意义,应上报疾控中心,相关行业标准在审批中。


分子技术在流行病学调查、宏基因组学以及新病原体的发现等领域的应用,对临床微生物室来说既是机遇也是挑战。临床微生物室应建立分子微生物学诊断平台,高通量多重PCR检测平台,用于中枢神经系统、呼吸道、血流和胃肠道感染的症候群常见多种病原体(细菌学、真菌学和病毒学)的综合检测;特别是自动化的、集成的、独立的一袋式(lab-in-a-pouch)密闭检测系统,集细胞裂解、核酸纯化、逆转录检测目标RNA、首轮PCR、多重PCR和第二轮的巢氏PCR阵列,软件自动执行扩增和熔解曲线数据自动得出目标测定结果。既提高了系统检测的敏感性和特异性,也消除了携带污染的问题。对于开放试剂体系,实时荧光RT-PCR仪是必备设备。


免疫学方法检测侵袭性真菌感染,如β-1-3-D-葡聚糖(G试验),半乳甘露聚糖(GM)试验,多数也在微生物室检测,与常规方法检测结果可以相互对照验证,提供给临床诊断依据。


本次问卷调查显示:临床微生物实验室现有分子检测的基本设备:普通PCR仪占14.5%,实时荧光RTPCR扩增仪占37.84%,芯片检测占4%,宏基因组测序仪占2.44%。免疫学方法检测侵袭性真菌感染:开展β-1-3-D-葡聚糖(G试验)52.88%,半乳甘露聚糖(GM)试验36.23%;内毒素试验37.84%,结核感染T细胞斑点试验(T-spot)25.78%,以上均未开展的实验室占24.9%。


六、临床微生物室检测能力分级


我国各省、市、县和区级公立医院的设立都是以综合医院为主,还设有专科医院、妇幼保健医院、儿童医院、中医院等,医院按病床数等相应指标进行分级。医改对二级、三级公立医院做了医疗定位,即二级医院接诊常见病和多发病,三级医院接诊疑难杂症和危重症。但同级别医院的微生物室的资源条件和检测能力、新升三级医院与老三级医院微生物室的检测能力存在不小差距。根据医院所在的行政级别、等级、门诊量、病床数、当地人口数、经济发展水平等因素,对各级医院的临床微生物室开展检测项目和检测能力最低要求提出以下建议。


(一)二级医院临床微生物室基本能力要求


在二级医院微生物室技术平台必备专业设备有:光学显微镜,普通培养箱,半自动微生物鉴定药敏系统。有条件的装备全自动微生物鉴定药敏仪。专业技术人员不少于3人。


1. 革兰染色及解释结果;抗酸染色及结果解释;墨汁染色查隐球菌;

2. 用直接抗体技术检测某种细菌;

3. 可对常见标本的基本处理和接种操作,提供培养物到其他实验室做鉴定和药敏试验;

4. 可对常见标本来源(如咽部、尿、子宫颈或尿道拭子、便等标本)做培养,分离常见的需氧细菌,并能鉴定到属或种水平;

5. 可对以上常见菌做常规药敏试验并解释结果;

6. 酵母样真菌鉴定到属或种水平;

7. 常规结核杆菌培养,培养物送到其他实验室鉴定。


(二)二级甲等医院临床微生物室能力要求


除以上所列设备,二级甲等医院微生物室技术平台必备专业设备:CO2培养箱,自动染片机,全自动微生物鉴定药敏系统;有条件的实验室配备:荧光显微镜、MALDI-TOF飞行质谱仪;应建立分子POCT检测平台。专业技术人员应不少于5人。除二级医院微生物室基本检测能力外,还应具备(不限于):


1. 可对常见感染部位来源的标本做培养,分离常见的需氧细菌及常见的苛养菌,并能鉴定到属或种水平;

2. 可常规做以上常见需氧菌和苛氧菌药敏试验并解释结果;

3. 常见酵母样真菌鉴定到种水平;

4. 有质谱仪的实验室可扩展对少见菌、分枝杆菌、丝状真菌等鉴定;

5. 可用分子POCT方法检测结核分枝杆菌及耐药性。


(三)三级医院临床微生物室常规要求(含三级专科医院)


除以上所列设备,三级医院临床微生物室技术平台必备专业设备:荧光显微镜、自动接种仪(标本量大时)、MALDI-TOF飞行质谱仪、实时荧光PCR仪、核酸自动提取仪、分子POCT检测平台。专业技术人员应不少于8人。除二级甲等医院微生物室应具有的能力外,还应具备(不限于):


1. 分离培养任何标本来源的需氧菌、感染常见厌氧菌、少见菌(奴卡菌等放线菌)、非结核分枝杆菌等,并鉴定到种或属水平;

2. 引起感染的主要酵母样真菌、侵袭性丝状真菌和皮肤真菌鉴定到属或种水平;

3. 可做各种有解释标准的需氧菌、感染常见厌氧菌、少见菌(当临床需要时)、酵母样真菌的药敏试验、侵袭性丝状真菌商品化试剂盒药敏方法(必要时);

4. 分子检测平台对病原体检测:可用分子POCT方法检测结核分枝杆菌及耐药性、对感染的系统性症候群检测病原、毒素、重要的耐药基因等;实时荧光PCR方法对病毒等非培养方法检测目标病原体等;

5. 开展β-1-3-D-葡聚糖(G)试验,半乳甘露聚糖(GM)试验;内毒素试验,结核感染T细胞斑点试验等。


(四)三甲(含三特)医院临床微生物室能力要求


三级甲等级医院临床微生物室技术平台必备专业设备:同以上设备;有能力的实验室可建立宏基因组mNGS测序平台;或了解此技术的进展和应用;建立其他针对感染性疾病诊断已有的检测平台和方法。专业技术人员应不少于10人。除以上三级医院临床微生物室应具有的能力外,还应具备(不限于):


1. 分离培养任何标本来源的微生物病原菌,包括需氧菌、各种厌氧菌、微需氧菌、分枝杆菌、放线菌等,并鉴定到种或属水平;

2. 分离培养引起临床感染的各种酵母样真菌、侵袭性丝状真菌和双相真菌、皮肤真菌,并鉴定到种水平;

3. 可常规做:各种有解释标准的需氧菌,厌氧菌,苛氧菌及少见菌药敏试验、酵母样真菌、侵袭性丝状真菌商品化试剂盒药敏方法;标准推荐的商品化试剂检测或筛查临床重要的细菌耐药性特殊表型;临床需要时可做特殊病原菌的微量肉汤法药敏试验;

4. 分子微生物诊断平台检测病毒和难培养目标病原体的核酸、感染症候群病原体、毒素、重要的耐药基因等;分子流行病学研究追踪院内感染的传播等;

5. 在宏基因组深度测序方法(mNGS)尚未通过CFDA注册之前,对不明原因的感染性疾病、疑难重症的标本外送或自己作为临床应用前研究,对潜在的新发传染病的发现,并可结合临床解释结果(作为技术储备平台);

6. 各种免疫学方法的抗原、抗体检测技术。


以上二级和三级医院微生物室能力划分不是绝对的,要因地域、人口、经济等诸多因素而定,资源共享、优势互补和集中检测是未来发展方向,检测能力突出的二甲和三甲医院的微生物室,可作为县级、地级市、市级和省级的区域中心实验室,帮助他们解决临床的疑难问题及作为技术支持。


七、展望


我国临床微生物检验近些年的进步是显而易见的,存在的问题也是相当多的,硬件方面多数实验室缺少足够的空间、仪器设备和试剂不足,信息系统需要更新;软件方面缺少具有丰富的实践经验、能与临床沟通、能综合运用各种方法解决临床感染的病原学诊断问题的专业技术人员。目前,要满足分级诊疗规划中的要求,二级医院和新升三级医院的微生物室的检验能力还需要进一步提升。我国的临床微生物学检测水平与国际同行仍有很大差距,需要各级政府的支持,上下齐心合力共克时艰,展望未来,任重而道远,我们怀有信心!


注:本文来源于《临床实验室》杂志2020年第10期“感染性疾病”专题


来自: 临床实验室 | 作者:胡继红 丛玉隆
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