找回密码
 立即注册

QQ登录

只需一步,快速开始

  • QQ空间
  • 回复
  • 收藏

你的P2实验室有资格做核酸检测吗?

归去来兮 2020-9-23 160人围观 机构



近日,新冠疫情在国内又有所波动,高风险地区也以最快速度开展应检尽检的全面核酸检测。

在5月21日发改委、卫健委和国家中医药局联合印发的“关于印发公共卫生防控救治能力建设方案的通知”里,也明确说明防疫常态化下,需要全面改善疾控机构设施设备条件,建设配备具传染病病原体、健康危害因素和国家卫生标准实施所需的检验检测能力的实验室

左右滑动查看两则快讯


在这些要求中,我们可以看到,生物安全二级 (P2) 水平的实验室是进行新冠核酸检测的最低要求。而要让生物安全等级达到 P2 ,需要实现:



生物安全达到二级 (P2)



遵循实验室生物安全等级,可以有效保护实验人员的安全,而在实验室里,采取一些防污染的措施,也能进一步保护实验人员的安全,并提高荧光 PCR 实验的准确度。

我们都知道,目前针对新冠检测最快速有效的方法,就是荧光 PCR。如果在对模板  DNA 中目的片段进行快速扩增时,混入了其他 DNA,那么就会产生污染,影响实验的准确性。

因此,要想得到真实有效的 PCR 结果,建立和保持 PCR 实验环境的洁净非常必要

那么有哪些措施可以保持 PCR 实验环境的洁净,并且有效预防污染发生呢,小 E 来简单介绍一下。


01

合理的实验室布局




对于 PCR 实验室的管理我国也在较早时期就出台了《医疗机构临床基因扩增管理办法》,在文件中对 PCR 实验室的建设也提出了明确的要求。

原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域:试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这 4 个区域在物理空间上必须是完全相互独立的,各区域无论是在空间上还是在使用中,应当始终处于完全的分隔状态,不能有空气的直接相通。



根据使用仪器的功能,区域可适当合并。例如使用实时荧光 PCR 仪,扩增区、扩增产物分析区可合并;采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪,则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。

各区的功能是:



01

试剂储存和准备区

贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备,以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。


序号

必备与选配的设备

推荐使用

1

2~8℃ 和 -20℃ 以下冰箱

_

2

混匀器

MixMate® 

3

微量加样器(覆盖 0.2-1000 µl)

Research® plus

4

可移动紫外灯(近工作台面)


_

5

消耗品:一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头

1.5ml 离心管和吸头

6

专用工作服和工作鞋(套)


_

7

专用办公用品


_



02

标本制备区

核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作,应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。


序号

必备与选配的设备

推荐使用

1

2-8℃ 冰箱、-20℃ 或 -80℃ 冰箱

F570

2

高速离心机

5425
5424 R

3

混匀器

MixMate® 

4

水浴箱或加热模块


ThermoMixer® C


5

微量加样器(覆盖 0.2-1000 µl)

Research® plus

Reference® 2

6

可移动紫外灯(近工作台面)


_

7

生物安全柜


_

8

消耗品:一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)

1.5ml 离心管和吸头

9

专用工作服和工作鞋(套)

_

10

专用办公用品

_

11

如需处理大分子 DNA,应当具有超声波水浴仪

_



03

扩增区

cDNA 合成、DNA 扩增及检测。


序号

必备与选配的设备

推荐使用

1

核酸扩增仪

_

2

微量加样器(覆盖 0.2-1000µl),(视情况定)

Research® plus 

Multipette® M4

Xplorer®

3

可移动紫外灯(近工作台面)


_

4

消耗品:一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)

1.5ml 离心管和吸头

5

专用工作服和工作鞋


_

6

专用办公用品


_



04

扩增产物分析区

扩增片段的进一步分析测定,如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。视检验方法不同而定,基本配置如下:


序号

必备与选配的设备

推荐使用

1

微量加样器(覆盖 0.2-1000µl )

Research® plus

2

可移动紫外灯(近工作台面)


_

3

消耗品:一次性手套、加样器吸头(带滤芯)

滤芯吸头

4

专用工作服和工作鞋


_

5

专用办公用品

_



临床基因扩增检验实验室的空气流向
临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照下图方向进行,防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。



可按照从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。


这样的实验室设计规范最核心的思想就是尽可能避免及降低实验室污染(主要为气溶胶污染)对实验结果的干扰以及对实验人员健康的潜在危害。


除了合理的实验室布局,在仪器和耗材方面也有一些小的注意事项。


02

使用带有预防污染功能的仪器和耗材




移液吸头



在整个PCR 工作流程中,每个步骤都会使用移液器进行微量试剂或样品的移取,实验室常用的微量移液器属于内置气体活塞式移液器,如果使用普通吸头,那么所移取的液体中如果存在DNA,在移取过程中由于蒸汽压作用,会进入移液器腔体中,形成携带气溶胶污染,吸放液的速度如果过快则更容易形成气溶胶;如果在不同步骤中使用相同的或者交叉的移液器,那么除了可能引起不同样品间的交叉污染外,还可能引起不同试剂的交叉污染。

所以在慢吸慢放液体的同时,我们可使用带滤芯的吸头进行整个 PCR 实验过程的液体移取。单层滤芯和双层滤芯对移液器腔体的保护效果如下图所示:


▲单层滤芯和双层滤芯对移液器腔体的保护效果示意图


PCR  仪与耗材



在 PCR 程序运行过程中,随着温度的升高,PCR 管中液体会形成蒸汽,带热盖功能的 PCR 仪可以有效减少 PCR 体系中液体的蒸发,在保证反应体系稳定的同时,减少了气溶胶污染的产生。热盖功能强大且与耗材适配性越好,样品蒸发的比例就会越小,引起的气溶胶污染就越少。当然需要配合高品质的耗材,才能将蒸发程度降到最低。


▲ 高品质的 Eppendorf twin.tec PCR 板



以上是关于 PCR 实验室污染及对策的一些简单的介绍,更为详细的关于实验室污染、如何建立实验室预防污染的对照体系以及如何在发生污染以后采取相应的应对措施的内容可以登录我们的  “We care - 现在和未来”  Eppendorf 病毒和疫苗研究专题页面,在该专题上您可以找到:

▶ 应对实验室污染的策略
▶ 实现实验室自动化的方案
▶ 提高疫苗开发效率的方法


来自: 生物探索 | 作者:艾本德
我有话说......