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PCR实验室:如何防止新冠病毒核酸检测假阳性?

班木芙兰 2020-6-18 104人围观 技术


核酸检测是新型冠状病毒检测的“金标准”,实时荧光定量RT-PCR法是临床检测常用方法,随着各级实验室该方法的广泛使用,大批量样本的临床检测,假阳性也是不容忽视的问题。荧光定量PCR假阳性简单来说就是在不该出现荧光信号的样本中出现了荧光信号,导致误判断阳性结果。


出现假阳性的原因主要有以下几个方面:

一、引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的基因序列。但在临床实际中,由于基本使用的是成品试剂盒,引物设计不合适的情况一般不会出现,但个别厂家试剂仍存在非特异性扩增现象,建议在使用前进行性能评价,比对筛选。


二、靶序列或扩增产物的交叉污染,这种污染有两种原因:1.是整个基因组或大片段的交叉污染导致假阳性。2.是空气中的小片段核酸污染,虽然这些小片段比靶基因序列短,但有一定的同源性。互相拼接后与引物互补结合,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生。在规范操作的前提下,应该尽量避免第二种情况的发生。

三、标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。  


四、PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。


五、实验室中克隆质粒的污染:试剂盒中的阳性对照参与核酸提取过程造成交叉污染,一些试剂盒为了监控核酸提取过程的质量,要求将试剂盒中的阳性对照(含有目的基因的假病毒)与样本一起进行核酸提取,自动化的核酸提取仪由于加温、振动等过程,在操作过程中气溶胶会可能会污染提取仪。有的实验室可能会将提取的核酸样本板加膜保存,以备扩增,再次打开封膜的样本板时可能会造成交叉污染。因此,不建议对提取后的样本核酸封膜保存,最好立即检测,同时,应对每一批提取后的仪器用75%酒精擦拭。

当PCR实验结果出现假阳性的时候,我们常常会考虑是不是引物、反应液、移液器等污染模板,然后需要一一排查,费时费力。其实产生这一现象最常见的原因是核酸气溶胶。离心机离心、剧烈地摇动反应管、PCR开盖、移液器的反复吹打等会产生空气与液体表面摩擦的情况,都会产生核酸气溶胶,也就是实验室里(或移液器腔内)弥漫着含有长短不一核酸片段的小颗粒,这些小颗粒沉降到样本中导致最后扩增出了假阳性荧光曲线。

可想而知,这些核酸小颗粒还会落到实验台面、PCR仪、移液器、吸头盒等等地方,如果我们不注意,这些核酸小颗粒就会日积月累地积聚,当实验室里核酸气溶胶的浓度达到一定浓度,就会造成实验室的污染进而产生PCR实验结果的假阳性。


那么我们平常工作应在以下几方面避免核酸气溶胶污染的产生:

一、试剂要提前分装:反应液尽量分装,避免多次取用,引物与探针稀释到一定浓度后分装,保证有备份,以防一管污染之后全军覆没;

二、水需要使用无RNA酶的去离子水,可以从试剂公司购买专用水;

三、加样时动作要小心轻柔,防止将模板吸入加样器内或溅出离心管外,加样顺序是最后加模板。

四、所用离心管及加样吸头均应一次性使用。必要时,使用前反应管用紫外线照射,以破坏存在的核酸。
五、机器运行完后,取出PCR产物时不能随便丢弃,应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。


在实验室日常管理方面应注意以下几方面:

一、实验室至少要分三区:试剂准备区、模板制备区、产物扩增分析区,各区配有单独移液器(有条件的每个区都应在不同的房间,这样才能最大限度的避免污染)。

二、实验室要注意风向和各区的压力差,相对压差也应从试剂准备至产物分析方向由高到低的过程;

三、定期清洁实验室,不同的区各有自己专用的抹布,台面、仪器、吸头盒、桌面、地面等接触面都需用不同浓度的含氯消毒剂擦拭清洁干净,仪器表面用75%酒精擦拭,危险区要多清洁,有条件的实验室宜采用全外排式送风。  


原作者: 大医一院检验科
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