酶标法、发光法手工操作你合格吗？

实习时老师是不是会仔细地教会你，要看你会不会拍马屁（比如努力干活）或者要看老师是不是喜欢你，以及老师是不是有心教会你，否则到了工作场所会被嫌弃和鄙视，想想都觉得小心脏要压爆了。我们一天工作的指针并不是把标本都检测干掉了，后续出问题被投诉时都是一地鸡毛。

试剂盒预温和孵育温度：试剂预温非常重要，环境温度高低变化导致系列标准品、阴性、阳性、质控结果上串下跳。因此我们必须控制好复温试剂盒和孵育时的环境温度，监控临界CUTOFF值标准品或质控品的稳定波动区域OD值或RLU。

科普：OD是吸光度值，光密度（optical density,OD）的简称，跟平时说的A值是一个意思；RLU是指发光法的“相对发光单位”（relative light unit,RLU），也可以理解成是不可见的发光光度值，表达方式不同。

质量稳定的试剂可能你会感觉不到温度对结果的影响，质量不稳定批号的试剂会让你无法发出报告，因为微小差别OD的结果会导致浓度值有天壤之别。大批量的标本尤其包括体检标本，可能总体阳性率不高时你会发现不到。而在第三方医学检验所，当同一家客户的标本阳性率过高，比如7/10，我相信你绝对没有胆量发出报告。又或者你的结果不稳定你根本没有觉察到，“高处不甚寒”，当你成为高手时你会很敏锐地发现问题。

如果你见到这篇文章，我希望你能回顾和观察一下。按说明书加样、孵育、洗板和读板操作是很多人都可以做到的事，只要是个地球检验人都可以做到的事，但是步步为营地控制质量、发现潜在的影响不是很多人能够做到的事。也许你会发现为什么有的同事一直没有发生过检验差错呢。

说明书通常要求提前20分钟即可预温试剂（保证试剂稳定和反应速度、减少冷凝水—微观性），其实不能一概而论，环境温度对于复温时间的长短很有影响的，说到底就是要测算出不同环境温度下复温的时间，否则就必须控制好空调温度处于室温范围，最佳温度是25℃，我们检验科实验室工作条件很好，上班时间一直开着空调，其实是为了实验结果准确而服务的，我们沾光了而已。我们做外周血瑞氏染色时间，冬天和夏天温度不同，我们都要进行试染来确定环境温度下多长染色时间合适，验证的标准就是试染片在显微镜下人工判断染色效果。

有的项目说明书孵育温度规定的是37℃，我们有很多文献报道“孵育使用漂浮在水浴箱中的托盘、反应板置放于湿化纱布上保温”。但是现在很多ELISA法、发光法定量项目要求温度是室温（发光法还要求存放在暗处避光温育）。

1、加样本位置应该是在反应板微孔板下1/3位置点，加试剂应该在反应板1/3稍上一点或者1/2位置，不要接触底部，因为底部是包被抗体或者抗原的位置（通常加量50-100ul，4℃冰箱过夜即可，然后洗涤拍干）。

2、加样枪必须使用匹配的吸咀，正确的操作应该是用手直接套上，然后再旋转1/3圈左右，达标标准是加样前中后均没有悬滴、加样后吸嘴里面没有残留液。

3、加样后容易产生气泡，也是大家很痛苦的事，显得很没有水准。其实还是因为吸嘴不匹配造成或者加样时没有贴壁，否则应该加样干净利落。当然也有好办法避免，大家通常没有习惯使用另外一种吸样方法——反向移液法：如需要吸样50ul，我们调档在50ul,但是我们吸样时按压到第一档位50ul后，继续用力按压加样手柄到底，然后轻轻松开，加样时压至第一档位50ul点即可，剩余在吸咀中的液体如果是样本建议弃去，如果是试剂不用弃去，继续吸取试剂循环加样，直至最后一次残留弃去。

4、加样本如果不是非常重要的科研，不建议每次加样都湿润吸嘴后重新吸样加孔，否则每个样本更换一次吸嘴外加湿化吸嘴会严重影响工作效率。但是吸标准液、阴性对照、阳性对照还是需要进行湿润一次吸嘴的习惯，以及慢慢地松开手柄吸样，因为只有如此你的结果才能非常稳定准确。

1.、通常加样后需要混匀微孔板至少3秒以上，简单的做法是用手把持住封膜板，缓慢地贴着桌面旋转几遍。如果你觉得混匀仪让你放心，也是可以的，但是切忌转速过快，如果有气溶胶或微滴撒在微孔口是不是很可怕，这种可怕来源于可能在你洗板时会跑到临近的微孔液体中，假如是高浓度的标本是不是会污染？

2、试剂盒里面的标准品、内对照阴性或阳性对照品，甚至我们冷冻过的标本，都是需要轻轻混匀8次以上，如果没有马上加样可以在加样前再混匀1-3次。冷冻过的标本都存在分层现象，剧烈混匀或混匀时间较长会产生气泡，有可能肉眼看不到，会影响结果的准确。抗原、抗体和包被微球毕竟是大分子颗粒物，还是需要混匀的。

通常应该是350ul左右，目的是接近满孔而不溢出，可以参照说明书进行。浸泡时间间隔目的是为了洗得更干净。有人会觉得干嘛要搞得这么复杂，其实本来就是应该这样，只是很多人并不喜欢循规蹈矩地按项目SOP和洗板机SOP规定去操作，简化操作很容易去做。

严谨的工作态度不仅仅是为了科学，更为了服务好患者，如果同期别的医院查出的结果与你的结果有差别，就不能靠报告单上备注“仅仅对此标本负责”逃避了，假如不一致呢？希望你做一名严师，并且还出高徒。我经常性地认为，应用工程师或者质检部的人员水平最高，我们实验室结果有任何异常，应第一时间想到他们，这是他们的任务，也不会嫌我们制造麻烦，找工程师是为了彼此进步。

总之，其实我们有时候会这么考虑“是否可以不用过多地重视环境温度的影响，我保持有做临界质控，只要质控结果稳定地区间波动，无论标准或对照孔OD值高低，反正标本的OD是同步影响的是相同条件对待的”。理论上是对的，实质上会影响反应的灵敏度或者潜在的影响会被忽视，结果一旦异常完全依赖于质控一孔控制是可怕的，如果结果异常了你是不是会去重新检测？别人下班了你还在为你的理念付出N多的时间加班。

虽然我们的操作很规范，但是质控不代表标本结果的可靠，质控只能说明没有出错的操作流程结果可靠，因此如果临床有质疑、患者前后结果不一致，无论有没有投诉都需要主动复查，不能依赖质控结果稳定和仅仅一孔论准确。