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酶标法、发光法手工操作你合格吗?

班木芙兰 2020-6-16 99人围观 技术


日常检验工作中,我们会发现酶标法、发光法,无论定性还是定量方法,使用96孔板或者48孔板,操作起来并不能很好地把控好结果准确,虽然我们总是用厂家性能指标声称的CV10-20%来谅解我们自己。笔者仔细地掰剥,发现很多操作环节,还是有必要注意,才能真正意义上保证检验质量。


实习时老师是不是会仔细地教会你,要看你会不会拍马屁(比如努力干活)或者要看老师是不是喜欢你,以及老师是不是有心教会你,否则到了工作场所会被嫌弃和鄙视,想想都觉得小心脏要压爆了。我们一天工作的指针并不是把标本都检测干掉了,后续出问题被投诉时都是一地鸡毛。


【温度】




试剂盒预温和孵育温度试剂预温非常重要,环境温度高低变化导致系列标准品、阴性、阳性、质控结果上串下跳。因此我们必须控制好复温试剂盒和孵育时的环境温度,监控临界CUTOFF值标准品或质控品的稳定波动区域OD值或RLU。

                                                

科普:OD是吸光度值,光密度(optical density,OD)的简称,跟平时说的A值是一个意思;RLU是指发光法的“相对发光单位”(relative light unit,RLU),也可以理解成是不可见的发光光度值,表达方式不同。

                                                           

质量稳定的试剂可能你会感觉不到温度对结果的影响,质量不稳定批号的试剂会让你无法发出报告,因为微小差别OD的结果会导致浓度值有天壤之别。大批量的标本尤其包括体检标本,可能总体阳性率不高时你会发现不到。而在第三方医学检验所,当同一家客户的标本阳性率过高,比如7/10,我相信你绝对没有胆量发出报告。又或者你的结果不稳定你根本没有觉察到,“高处不甚寒”,当你成为高手时你会很敏锐地发现问题。


如果你见到这篇文章,我希望你能回顾和观察一下。按说明书加样、孵育、洗板和读板操作是很多人都可以做到的事,只要是个地球检验人都可以做到的事,但是步步为营地控制质量、发现潜在的影响不是很多人能够做到的事。也许你会发现为什么有的同事一直没有发生过检验差错呢。



说明书通常要求提前20分钟即可预温试剂(保证试剂稳定和反应速度、减少冷凝水—微观性),其实不能一概而论,环境温度对于复温时间的长短很有影响的,说到底就是要测算出不同环境温度下复温的时间,否则就必须控制好空调温度处于室温范围,最佳温度是25℃,我们检验科实验室工作条件很好,上班时间一直开着空调,其实是为了实验结果准确而服务的,我们沾光了而已。我们做外周血瑞氏染色时间,冬天和夏天温度不同,我们都要进行试染来确定环境温度下多长染色时间合适,验证的标准就是试染片在显微镜下人工判断染色效果。


有的项目说明书孵育温度规定的是37℃,我们有很多文献报道“孵育使用漂浮在水浴箱中的托盘、反应板置放于湿化纱布上保温”。但是现在很多ELISA法、发光法定量项目要求温度是室温(发光法还要求存放在暗处避光温育)。


加样枪和加样操作




1、加样本位置应该是在反应板微孔板下1/3位置点,加试剂应该在反应板1/3稍上一点或者1/2位置,不要接触底部,因为底部是包被抗体或者抗原的位置(通常加量50-100ul,4℃冰箱过夜即可,然后洗涤拍干)。


2、加样枪必须使用匹配的吸咀,正确的操作应该是用手直接套上,然后再旋转1/3圈左右,达标标准是加样前中后均没有悬滴、加样后吸嘴里面没有残留液


3、加样后容易产生气泡,也是大家很痛苦的事,显得很没有水准。其实还是因为吸嘴不匹配造成或者加样时没有贴壁,否则应该加样干净利落。当然也有好办法避免,大家通常没有习惯使用另外一种吸样方法——反向移液法:如需要吸样50ul,我们调档在50ul,但是我们吸样时按压到第一档位50ul后,继续用力按压加样手柄到底,然后轻轻松开,加样时压至第一档位50ul点即可,剩余在吸咀中的液体如果是样本建议弃去,如果是试剂不用弃去,继续吸取试剂循环加样,直至最后一次残留弃去。


4、加样本如果不是非常重要的科研,不建议每次加样都湿润吸嘴后重新吸样加孔,否则每个样本更换一次吸嘴外加湿化吸嘴会严重影响工作效率。但是吸标准液、阴性对照、阳性对照还是需要进行湿润一次吸嘴的习惯,以及慢慢地松开手柄吸样,因为只有如此你的结果才能非常稳定准确。


混匀方式




1.、通常加样后需要混匀微孔板至少3秒以上,简单的做法是用手把持住封膜板,缓慢地贴着桌面旋转几遍。如果你觉得混匀仪让你放心,也是可以的,但是切忌转速过快,如果有气溶胶或微滴撒在微孔口是不是很可怕,这种可怕来源于可能在你洗板时会跑到临近的微孔液体中,假如是高浓度的标本是不是会污染


2、试剂盒里面的标准品、内对照阴性或阳性对照品,甚至我们冷冻过的标本,都是需要轻轻混匀8次以上,如果没有马上加样可以在加样前再混匀1-3次。冷冻过的标本都存在分层现象,剧烈混匀或混匀时间较长会产生气泡,有可能肉眼看不到,会影响结果的准确。抗原、抗体和包被微球毕竟是大分子颗粒物,还是需要混匀的。


洗板液量和浸泡间隔时间




通常应该是350ul左右,目的是接近满孔而不溢出,可以参照说明书进行。浸泡时间间隔目的是为了洗得更干净。有人会觉得干嘛要搞得这么复杂,其实本来就是应该这样,只是很多人并不喜欢循规蹈矩地按项目SOP和洗板机SOP规定去操作,简化操作很容易去做。


严谨的工作态度不仅仅是为了科学,更为了服务好患者,如果同期别的医院查出的结果与你的结果有差别,就不能靠报告单上备注“仅仅对此标本负责”逃避了,假如不一致呢?希望你做一名严师,并且还出高徒。我经常性地认为,应用工程师或者质检部的人员水平最高,我们实验室结果有任何异常,应第一时间想到他们,这是他们的任务,也不会嫌我们制造麻烦,找工程师是为了彼此进步。

   

总之,其实我们有时候会这么考虑“是否可以不用过多地重视环境温度的影响,我保持有做临界质控,只要质控结果稳定地区间波动,无论标准或对照孔OD值高低,反正标本的OD是同步影响的是相同条件对待的”。理论上是对的,实质上会影响反应的灵敏度或者潜在的影响会被忽视,结果一旦异常完全依赖于质控一孔控制是可怕的,如果结果异常了你是不是会去重新检测?别人下班了你还在为你的理念付出N多的时间加班。

    

虽然我们的操作很规范,但是质控不代表标本结果的可靠,质控只能说明没有出错的操作流程结果可靠,因此如果临床有质疑、患者前后结果不一致,无论有没有投诉都需要主动复查,不能依赖质控结果稳定和仅仅一孔论准确。


我有话说......