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文章来源：中华检验医学杂志,2019,42(12): 1014-1019 作者：国家卫生健康委临床检验中心新生儿遗传代谢病筛查室间质评委员会
先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一种由肾上腺皮质激素合成过程中所需酶缺陷引起的常染色体隐性遗传病[1]。按照酶缺陷类型的不同，可分为21-羟化酶缺乏症（21-hydroxylase deficiency，21-OHD）、11β羟化酶缺乏症（11 beta hydroxylase deficiency，11β-OHD）、3β羟类固醇脱氢酶缺乏症（3 beta hydroxysteroid dehydrogenase deficiency，3β-HSD）、17α-羟化酶缺乏症（17alpha-hydroxylase deficiency，17α-OHD）、20,22-碳链酶缺乏症、类固醇激素急性调节蛋白（steroid hormone acute regulatory protein，StAR）缺陷症及17β-羟类固醇脱氢酶（17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD）缺陷症等。其中21-OHD最常见，约占CAH的90%~95%；11β-OHD次之，占5%~8%；3β-HSD，约占<1%；其他类型罕见[2,3]。新生儿CAH筛查以21-OHD类型为主，本病由基因突变导致酶缺陷，继而引起皮质醇激素合成不足，经下丘脑-垂体-肾上腺轴反馈调节，促使垂体分泌的促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）增加，致使肾上腺皮质增生，可引起皮质醇前体物质分泌过多而出现一系列临床症状，临床以血清17α-OH孕酮升高为典型特征。CAH在活产新生儿中发病率约为1/10 000~1/20 000，通过新生儿筛查，及早发现患儿并及时治疗，尽可能预防肾上腺皮质危象的发生，可避免患儿脑损伤或死亡的发生，防止女性患儿由于雄激素分泌增加而引起外生殖器男性化造成的性别误判，进而预防性激素分泌异常可能带来的心理、生理发育障碍[4,5,6,7]。全国多个省份已经将CAH列入新生儿疾病筛查常规项目，但不同实验室在检测方法、筛查流程及诊断等检测技术及管理方面还存在差异，标准不一。为规范新生儿CAH实验室检测技术与管理，国家卫建委临床检验中心新生儿遗传代谢病筛查室间质评委员会组织专家，经过多轮讨论，达成以下共识。
一、新生儿CAH筛查目标、对象及流程 通过新生儿CAH筛查，早期发现CAH患儿，对患儿进行及时干预治疗，实现对CAH出生缺陷的防控。按照2010版《新生儿遗传代谢病筛查血片采集技术规范》要求采集足跟血，测定干血滤纸片中17α-羟基孕酮（17-α-hydoxy progesterone，17α-OHP）浓度，根据浓度切值，作出判断[8,9]。筛查阳性患儿通过进一步实验室检查进行确诊，确诊患儿及时接受治疗，推荐筛查流程见图1。
注：虚线表示备选方案；CAH表示先天性肾上腺皮质增生症；17α-OHP示17α-羟孕酮；TRFIA示时间分辨荧光免疫分析法；LC-MS/MS示液相质谱-串联质谱法
二、新生儿CAH筛查及诊断实验室设置要求 新生儿CAH筛查实验室应符合《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》和《医疗技术临床应用管理办法》的相关要求，以规范实验室管理，保障检验质量和实验室生物安全，保证临床诊断和治疗科学性、合理性[10,11,12]。此外，作为筛查及诊断实验室还应达到以下要求。
新生儿CAH筛查实验室所在医疗机构资质、技术人员资质以及实验室的设置应符合《新生儿疾病筛查技术规范》（2010）的要求[8]。新生儿CAH诊断实验室在实验室人员设置、工作区域及仪器配置、数据解读、质量控制等方面应遵从《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的相关规定[13]。
三、新生儿CAH筛查 CAH筛查主要的方法有ELISA、时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）及液相质谱-串联质谱法（liquid phase mass spectrometry-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等。新生儿CAH一级筛查常用方法为TRFIA，此方法具有较高的特异度与灵敏度的优点。新生儿CAH二级筛查常用方法为LC-MS/MS法筛查。采用固相二抗抗原竞争法，固相上带有第二抗体，血片中17α-OHP与示踪物Eu+标记17α-OHP共同竞争第一抗体结合，形成的抗原-抗体复合物，同时被固相第二抗体结合，在微孔表面形成二抗-一抗-抗原-Eu复合物。经洗涤除去剩余Eu+标记17α-OHP，加入增强剂，分离结合在固相上的Eu+，并与其形成强荧光螯合物，然后进行测定，标本中17α-OHP浓度与荧光强度呈反比。CAH二级筛查采用LC-MS/MS技术，用含内标d8-17羟基孕酮（d8-17-hydoxy progesterone，d8-17OHP）和d2-皮质醇的萃取液将血斑中的17α-OHP、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质醇和雄烯二酮洗脱出来，经过高效液相色谱柱进行分离后，进入质谱采用多反应监测模式进行数据采集，完成各个检测物的定量[9]。尚无商品化试剂盒。实验室采用LC-MS/MS技术进行CAH筛查时，宜采用内标法，根据内标的浓度定量分析目标物的浓度。同时所采用设备应满足基本的性能要求，液相分离部分：宜采用dC183 μm，2.1 mm×20 mm IS色谱柱与C18 4.0 mm×2.0 mm ODS预色谱柱进行色谱分离后再进入质谱进行检测；质谱检查部分：毛细管电压3.5 kV，离子源温度120 ℃，去溶剂气温度300 ℃，真空压不低于-2.2×103 mbar。筛查实验室应当对采用的检测系统的性能进行验证或确认，评估结果与操作说明书一致，才可以用于临床服务。性能验证时需包含精密度、准确度、线性范围等评价指标；其中批内不精密度和批间不精密度应分别小于最大允许误差的1/4和1/3；评价准确度时符合标准的检测值通过率应≥80%，达到卫建委室间质评的基本要求；线性范围评价时，对线性回归方程Y=aX+b及相关系数R2的要求为，R2≥0.95，a在0.97~1.03范围内。评价方法参见美国CLSI关于精密度（EP15-A，EP5-A）、准确度（EP9-A2）、线性范围（EP6-P）、干扰实验（EP7-P）等的评价指南[14]。实验室自建方法，临床应用前应进行方法确认，通过确认的方法才能用于筛查。方法确认的考核指标，应包括基质效应、干扰试验、线性、精密度、正确度、特异度和携带污染；在进行正确度评估时，应完成回收率、方法比较、仪器间比较等分析；考核标准参考检测程序的验证部分。经过验证或确认的检验程序，其标准操作规程发生变化、仪器被重新组装、发生严重检测失败事件采取重大纠正措施后，检验程序需要重新完成方法学评估且结果达到要求、经实验室质量负责人确认后方能再次使用。新生儿血17α-OHP浓度的参考区间值因出生体重、孕龄、检测方法以及检测平台而异。各筛查中心可根据本地筛查统计资料、检测方法及平台等制定合理的参考区间值，具体方法可参考美国临床实验室标准化委员会（CLSI）《关于临床实验室如何确定和建立生物参考区间的标准与指南》（2000）[15]。基于自动免疫测定系统及配套新生儿17α-OHP测定试剂盒（时间分辨荧光分析法）测定新生儿足跟血17α-OHP浓度参考值，见表1，供参考。实验室在进行筛查实验时，仍需要对参考值进行验证，必要时自建。基于其他改良方法或平台进行筛查时，各筛查中心应根据本地筛查数据优化参考值的设定[16,17,18]。
LC-MS/MS法CAH二级筛查尚无商品化试剂盒，筛查中心应参考实验室自建方法（laboratory developed tests, LDT）进行参考区间的设置[15,19,20]。参考区间的建立与评估应遵循以下步骤。样品分析：收集足够数量的正常标本，至少一万份健康新生儿标本进行分析；针对不同时期新生儿（大于7 d、早产儿）所采集的标本，建议设立不同的样本组，分别建立检测指标浓度参考区间。参考区间设置：推荐采用百分位数法建立的参考区间，以排除检测指标浓度值非正态分布的影响。百分位数范围98.0%~99.9%，具体取决于检测指标在疾病组和正常组分布的重叠情况。参考区间验证：初次建立的参考区间需进行验证。可以同已发表的文献及其他实验室采用同样方法和仪器建立的参考区间进行比较；推荐通过室间质评能力测试计划来验证本实验室设立的检测指标参考区间的适宜性。参考区间评估：检测指标参考区间应进行定期和持续的评估，根据假阳性率或数量，对参考区间进行调整。定期评估时可结合基因诊断和其他确诊实验的结果，以评价各检测指标参考区间的适宜性，必要时进行适当的调整。
四、CAH诊断 初次筛查阳性的新生儿，需进一步确诊。以ELISA、TRFIA作为CAH一级筛查方法的，确诊时需补充生化检测，并最终进行基因诊断确诊；以LC-MS/MS为一级或二级筛查方法的，若筛查指标已包含类固醇激素，补充生化检测时可不再测同类指标，若筛查指标未包含类固醇激素，则应同时完成生化检测和基因诊断，以进行疾病确诊。
生化检查血液包括钠（Na）、钾（K）、血浆肾素活性（plasma renin activity，PRA）、醛固酮（aldosterone，AAldo）、17α-OHP、脱氧异雄酮（deoxyisoandrosterone，DHEA）、雄烯二酮、脱氧皮质酮（deoxycorticosterone，DOC）、孕酮及睾酮；尿液包括17-羟皮质类固醇（17-hydrocorticosteroid，17-OHCS）、17-酮类固醇（17-ketosterol，17-KS）和孕三酮[9,18]。各类型CAH生化特征见表2。
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