【指南与共识】荧光定量PCR技术应用于产前诊断常见染色体非整倍体实验室检测质控规范 ...

一、检验前技术流程与质控要点

（一）检测适用范围

在产前诊断中，QF-PCR技术主要应用于21/18/13三体综合征和性染色体非整倍体快速产前辅助诊断。尽管国内外有建议，针对高龄孕妇和产前筛查提示染色体非整倍体高风险的孕妇，同时无既往不良孕产史、超声筛查正常者，可单独进行QF-PCR检测^[4]，但考虑我国临床实际情况，建议QF-PCR检测应同时结合后续染色体核型分析。

当采用其他分子技术进行产前诊断，如单基因遗传病产前诊断时，可结合QF-PCR技术，以排除标本母体DNA污染并同时检测5种常见染色体非整倍体异常。多胎妊娠产前诊断时，可结合QF-PCR技术判断胚胎来源，并排除重复采集到同一个胎儿样本的风险。

（二）检测前咨询和标本采集

实验室应将该技术的原理、局限性、伦理要求等与临床医师有充分的沟通。医师应当对孕妇本人及其家属详细告知QF-PCR检测的目标疾病、目的、意义、准确率、技术局限性、风险和其他筛查与诊断方案，以及伦理要求等情况，与孕妇本人或其家属签署知情同意书，做好相关临床信息的详细准确采集。

超声引导下抽取孕妇羊水、绒毛、脐血以及孕妇的外周血等。羊水和绒毛采用无菌离心管采集，绒毛需用生理盐水浸泡，脐血采用常规EDTA抗凝采血管采集。所需标本量为羊水1~5 ml，或绒毛0.2~2 mg，或脐血0.2~2 ml。

采集的标本应在2~8 ℃条件下保存及运输。羊水采集后3 h内完成离心沉淀羊水细胞，所有标本采集后48 h内完成DNA的提取（考虑到胎盘嵌合体现象，绒毛标本提取DNA时应尽可能使用多条绒毛的混合细胞提取）。

标本采集时，应同时采集孕妇外周EDTA抗凝血1~2 ml用于母体污染排除实验。该采血管编号应与胎儿标本编号建立一对一联系。

（三）标本接收

标本送达实验室后，应检查原始标本标识、标本采集管类型、标本状态（如是否颜色异常、血丝、凝块等）以及与申请单内容的一致性。

（四）检验前质控要点

1．样本要求：

正常羊水标本离心后可见白色或淡黄色沉淀，无肉眼可见的母血，绒毛标本应该无血丝，脐血标本无凝块。如果羊水有母血污染或颜色异常的沉淀、绒毛有血丝等情形需注明并结合母体DNA污染排除实验^[5]。

2．质控未通过样本的处理：

对以下不符合检测要求的标本，实验室应及时与临床医生沟通反馈：羊水和绒毛母血污染严重、羊水量不足、脐血采血量不足、抗凝剂使用不正确、严重血凝块、标本采集管破裂及开盖、标本标识不清；标本未按照规定保存及运输；影响检测结果的重要信息不完善^[6]。为保证检测质量，此类标本不能进行QF-PCR检测。其后续可根据染色体核型分析得出结果或重新采集标本检测。

二、检验中技术流程和质控要点

实验室需建立QF-PCR检测独立标准操作程序文件体系。

（一）检验方法的性能验证

实验室首选的检验程序应当是体外诊断医疗器械使用说明中规定的程序，并在应用前对该程序进行独立验证，通过获取客观证据证实检验程序的性能与其声明相符（性能包括检测准确度、分析敏感度、分析特异度、检出限等），同时，实验室应将验证程序文件化，并记录验证结果。若实验室对检验程序进行变更时，应将改变所引起的影响文件化，并重新验证更改后的检验程序^[7]。

（二）DNA的提取

注意QF-PCR检测不同标本类型DNA提取方法存在差异。羊水需1 530×g离心5 min、绒毛消化时间为1 h、脐血需要RNA酶处理。

（三）PCR扩增

实验室应确定合适的QF-PCR循环数（建议24~26个循环），以确保产物扩增处于指数增长期。

（四）数据分析和结果判读

实验室应具有合适的分析软件，分析软件应至少能区别2 bp差异的电泳峰。

所有电泳检测数据应建立电子表格分析，电泳峰值面积和峰高达到可判断阈值时可用于结果分析。实验室应建立参考峰比值（一般正常参考比值范围为0.8~1.4；异常参考比值范围为≤0.65或≥1.8；1.4~1.8和0.65~0.8为灰区）^[2,8]。

某一条染色体上超过两个STR位点出现1∶1∶1三峰或1∶2、2∶1双峰，且其他染色体STR检测正常时，提示该染色体三体。仅一个STR位点出现1∶1∶1三峰或1∶2、2∶1双峰，不能确定其为染色体三体，需要复查。

某一条染色体同时出现异常和正常等位基因型时，要考虑染色体不平衡异位、拷贝数变异（copy number variation，CNV）和引物结合位点多态性变异的可能。

某一条染色体上有单个或多个STR位点出现多余等位基因（三体最多出现3个等位基因），应考虑嵌合体可能。

（五）检测结果的出具

建议采集标本后3个工作日内，由产前诊断机构出具临床报告。实验室只能出具检测报告，临床报告必须由产前诊断机构具备产前诊断资质副高以上职称临床医师审核签发。

临床报告应包括以下信息：送检单位和送检医师姓名、检测单位和检测人员信息、孕妇基本信息、标本信息、检测项目、检测方法、检测方法的局限性、目标疾病检测结果、异常结果以及对结果的描述与建议。报告中不得有性别提示。对检测失败的标本，应当发放检测失败报告并注明原因。

（六）检验中质控要点

1．DNA质控：

提取的DNA应采用紫外可见分光光度计进行纯度和浓度的质控。纯度要求：A_260/280应介于1.7~1.9之间，浓度要求>10 ng/μl。需要注意的是脐血来源的DNA标本通常含有大量的RNA，A_260/280通常高于1.9，从而影响对DNA的准确定量，因此在提取脐血标本时需加入RNA酶进行消化处理^[9]。标本纯度满足质控要求后根据A₂₆₀数值计算DNA浓度，浓度应满足所采用试剂盒说明书的要求，通常应>10 ng/μl。

2．母血污染排除：

每例产前诊断标本均需同时做母体DNA污染排除实验。如发现母体DNA污染，建议标本废弃，并对后续核型分析培养细胞加做母体DNA污染排除实验，以确定培养细胞是否为胎儿细胞^[10]。

3．不合格样本的处理：

对不合格标本，如胎儿标本中混有母体组织细胞、整批结果峰值低于试剂盒要求的最低阈值、DNA浓度低、背景信号强、阴阳性质控未通过、空白对照出现产物峰等提示实验失败，需反馈实验负责人，安排失败标本重检测或重采样^[11]。

4．结果质控：

实验室应当按照检测方法相关说明书要求建立有关结果质量参考标准。检测质量合格的标本应当严格按照产品说明书进行实验室结果判读。检测质量不合格的标本应当重新提取DNA再次检测，再次检测后仍不符合数据分析或结果判断质量要求的标本，实验室应当与临床医生充分沟通后确定后续处理。

5．对照实验：

检测关键步骤应双人实验、双人复核。检测每个批次各过程均应插入阴阳性对照品和空白对照品，与临床样品同步检测。若空白标本检测出目的产物峰，提示空白标本被污染或混淆，则该批次标本结果不可信，需安排该批标本重新实验。若阳性标本检出阴性，提示扩增系统出现问题，需检测扩增试剂和设备是否异常，并安排该批次标本重新实验；如果数据分析质控标本检测结果与预期结果不一致，则提示标本混淆，该批结果不可信，需安排该批次标本重新实验。及时对失控情况进行原因分析，以保证实验室检验结果的准确和可靠。

6．室间质评：

实验室应参加适于QF-PCR检测项目的室间质量评价计划，若无室间质量评价计划可利用时，应参加国际相关质量评价计划或联合多家实验室开展室间评价。当室间评价不符合预定的评价标准时，应实施并记录纠正措施，同时监控纠正措施的有效性^[12]。

三、检验后技术流程和质控要点

（一）检测后的咨询与处置

1．异常结果报告解读：

检测报告为异常的，检测者应尽快通知相关实验负责人重点关注该病例，加快后续核型分析，尽快出具相应的报告。

如受检者是在进行单基因遗传病分子诊断时同时应用QF-PCR技术检测常见5种染色体的数目，或者受检者因为其他常见染色体数目异常诊断的分子诊断技术（如荧光原位杂交技术）的结果异常或不明确而采用QF-PCR技术进行验证时，产前诊断机构应尽快通知受检者到本机构进行后续遗传咨询。

产前诊断机构应当负责异常病例的后续临床咨询和妊娠结局，临床咨询率应达到100%。

2．正常报告解读：

检测结果为未见明显异常，则说明胎儿患常见5种染色体非整倍体的风险很低。但检测结果为正常不排除其他染色体异常的可能以及胎儿患21号、18号、13号、X、Y染色体结构异常和嵌合型三体综合征，以及其他因素所引起的智力障碍、畸形等疾病。应建议孕妇完成胎儿系统B超等检查及定期进行常规产检。

3．其他：

同一条染色体上的不同标记位点同时出现正常和异常结果，提示部分染色体不平衡或者存在CNV多态性的可能。结果判断时需谨慎，建议检测双亲标本以明确多态性，并同时慎重考虑结合其他诊断方法进行确诊。

考虑到限制性胎盘嵌合体情况，绒毛标本检测异常时，解释要慎重，建议结合核型分析和进行后续的羊水产前诊断以进一步确诊。

报告提示检测失败要求重新采样，应告知临床医师失败原因及避免方案，根据知情同意书内容告知该检测的局限性及影响因素，并对受检者说明医师认为应该说明的其他问题。

胎儿影像学检查发现异常，则无论QF-PCR检查结果是异常还是正常，都应当对其进行专业的遗传咨询及后续相应的诊断服务。

（二）妊娠结局随访

采样机构应当负责对孕妇的妊娠结局进行追踪随访。对检测结果为异常的孕妇，妊娠结局随访率应达100%；对检测结果为正常的孕妇，妊娠结局随访率应达90%以上。随访内容应包括：足月产或流产、引产、早产、死产、死胎等妊娠结局；是否为21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征、性染色体数目异常的患儿；有条件的机构可将后期流产、死胎的遗传学诊断纳入妊娠结局随访内容。随访应至少至分娩后12周，有条件的机构可随访至分娩后1年。

（三）检测后质控要点

实验室应当制定专门制度文件，严格保护孕妇隐私，严禁泄露受检者信息及胎儿性别。检测数据应当进行安全备份，并与互联网物理隔离。检验结果报告后，可追溯的检测核心数据、检测记录和剩余标本应保存至少1年。检测剩余标本须保存于-70 ℃，以备复查。

共识专家组成员

（周裕林、夏众敏、黄烁丹、郭奇伟　执笔）

共识专家组成员（按姓氏笔画排序）：国家卫生健康委临床检验中心/北京医院国家老年医学中心（王治国）；湖北省妇幼保健院保健部（王维鹏）；海南省妇女儿童医学中心检验科（王洁）；河南省人民医院医学遗传研究所（王莉）；江苏省妇幼保健院产科产前诊断中心（王珏）；内蒙古自治区妇幼保健院遗传优生科（王晓华）；浙江大学医学院附属儿童医院浙江省新生儿疾病筛查中心（曲一平）；河北省保定市妇幼保健院医学遗传科（李伟）；青岛大学附属医院医学遗传科（刘世国）；沈阳安联妇婴医院遗传中心（张莉）；浙江省湖州市妇幼保健院产前诊断科（沈国松）；浙江大学医学院附属儿童医院遗传代谢科（黄新文）；广西壮族自治区妇幼保健院儿科（范歆）；厦门市妇幼保健院产前诊断中心（周裕林）；吉林大学第一医院基因诊断中心（姜艳芳）；徐州市妇幼保健院遗传医学中心（顾茂胜）；福建省妇幼保健院产前诊断中心（徐两蒲）；上海交通大学附属第一人民医院产前诊断中心（陶炯）；湖南省妇幼保健院医学遗传科（唐华）；山东大学附属省立医院产前诊断中心（贾颐舫）；西北妇女儿童医院产前诊断中心（强荣）；大连市妇幼保健院遗传代谢医疗中心（曹东华）；广东省梅州市妇女儿童医院医学遗传中心（黄烁丹）；广州医科大学附属第三医院妇产科研究所实验部（黎青）