MALDI-TOF MS在临床微生物鉴定中的标准化操作专家共识

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of- flight massspectrometry, MALDI-TOF MS）技术，简称飞行质谱技术，是近年来临床微生物鉴定领域最具代表性的技术之一。每种微生物都由自身独特的肽/蛋白质组成，通过MALDI-TOF MS检测微生物的肽/蛋白质指纹图谱，经软件处理并与微生物数据库进行比对分析，可在几分钟之内完成对微生物种、属水平的鉴定^[1,2]。与传统的检测微生物表型和生理生化方法相比，MALDI-TOFMS具有快速、准确、高通量、和低成本的优势^[3,4]。除了可鉴定常见细菌和酵母样真菌^[5]，更极大提高了临床微生物实验室对苛养菌、厌氧菌、丝状真菌以及分枝杆菌等难鉴定微生物的鉴定效率和能力^{[6,7,8,9,10,11,12]}。对MALDI-TOF MS系统开发耐药性分析、细菌同源性分析及阳性血培养、无菌体液细菌直接鉴定等工作尚处在科研阶段^{[13,14,15,16,17,18,19]}，随着研究的成熟和标准化的实现，有望逐步从研究走入临床应用。

配备MALDI-TOF MS仪器的实验室越来越多，飞行质谱仪的操作看似简单，但在临床应用阶段时常存在由于操作不够规范而导致鉴定结果出现问题的情况，因此飞行质谱的操作使用，包括样品选择、前处理流程、鉴定流程、报告原则及审核、解释和错误排查、质量控制、生物安全及仪器日常维护等仍有待于实现进一步的标准化。本共识旨在强调规范操作，提升使用MALDI-TOF MS的鉴定水平，提高临床工作中的质量和效率，并不涉及其科研方面的应用内容。目前，进口和国产的微生物MALDI-TOF MS均有上市，除特别标注外，本共识所涉及的标准化内容适用于所有的微生物MALDI-TOF MS系统。

MALDI-TOFMS质谱仪目前尚不能用于对临床标本和混合培养物的直接检测，分析对象必须是分纯的微生物，其对微生物的高准确性及可重复性鉴定是基于对微生物核糖体蛋白（相对分子质量2 000~20 000）的检测，这是一类在微生物胞内固定表达的高丰度蛋白，因此，理论上不同的培养条件不会导致MALDI-TOF MS的鉴定结果的明显差异^[3,20]。但是为了达到更理想的鉴定结果，实验室应尽量选择不会干扰鉴定的培养条件。

（一）固体与液体培养基

对于同一种微生物而言，尽管固体培养基和液体培养基获得的图谱可能存在一定的差异，鉴定结果并不受影响^[4]。但对于常规鉴定来说，临床样本的培养应使用固体培养基，以获得单一的纯菌落进行鉴定。如果使用液体培养基，则必须保证培养物的纯度，并且需要在分析前进行富集及洗涤操作^[4]。对这类特殊样本可根据厂家建议选择液体培养基，通过离心、清洗等步骤后进行质谱鉴定^[12,21]。

（二）选择性与非选择性培养基

使用选择性或非选择性培养基通常不会影响MALDI-TOF MS鉴定结果的准确性^[22,23]。针对同一株细菌而言，某些选择性培养基对于获取的图谱质量可能产生不良影响，导致低分值鉴定或无鉴定结果^[20]，建议实验室尽量选择非选择性培养基进行细菌培养。

（三）培养条件和时间

MALDI-TOFMS鉴定细菌通常需要105~107菌落形成单位（CFU）的菌量。通常孵育温度、气体环境等不同的培养条件不会对MALDI-TOF MS检测的图谱质量及鉴定准确性产生影响^[20,24,25]。建议以获得足够的新鲜培养物为目的，用最适培养条件对微生物进行培养，并使用足量、新鲜的培养物进行鉴定。

通常情况下，细菌和酵母样真菌培养18~24 h即可获得用于MALDI-TOF MS鉴定的足够生物量（核糖体蛋白）^[20,25]；某些厌氧菌需要将培养时间延长至72 h^[26]；丝状真菌应培养至生长出明显菌丝，产孢前或刚产孢时进行鉴定为最佳^[6,27]，避免难破壁的孢子或色素的干扰；不同类型的分枝杆菌培养时间不同，多数快生长分枝杆菌培养时间<7 d即可得到肉眼可见的用于鉴定的菌落，而慢生长分枝杆菌则需要培养≥7 d^[28,29]。不同类型微生物孵育时间建议见表1。

表1 不同类型微生物孵育时间

短时间的培养一般不会影响鉴定结果，但因不能确定是纯菌落，如果是混合生长则导致鉴定失败；对于产孢子的微生物，培养时间过长导致蛋白峰信号和图谱质量下降，降低了鉴定的可信度，这种情况需重新传代培养再鉴定^[28]。

因临床需求，一些实验室采用短时间培养（6~8 h）后刮取菌膜做质谱鉴定，该方法只能鉴定某些快生长细菌，不能可靠地鉴定所有微生物^[30]，且无法鉴别是否为混合生长。短时间培养的鉴定结果只能发送初步报告，需注明"以最终的鉴定报告为准"。

（一）不同前处理方法的适用微生物范围及效果

MALDI-TOFMS鉴定的前处理步骤主要是通过破坏微生物的细胞结构，达到灭活微生物样本并提取胞内蛋白的目的。微生物细胞壁的结构和成分，是影响前处理效果的最重要的因素[31]，因此，样本破壁效果直接影响是否有足够的蛋白用于质谱的分析，是决定鉴定能否成功的前提。根据微生物的细胞壁结构和成分差异，可将MALDI-TOF MS微生物鉴定前处理方法分为五类^{[31,32,33,34,35,36]}，其适用范围见表2，如果基础的提取方法不能达到预期的鉴定效果，则可以尝试使用更复杂的提取方法。具体在各个MALDI-TOFMS平台上的标准操作流程仍须由生产商进行验证并提供。

表2 不同微生物适用的前处理方法及效果评价

（二）靶板涂布的注意事项

从培养基上挑取合适的菌量转移至靶板上相应的靶点位置，使用一次性接种环或无菌竹签轻轻涂抹，使菌苔在靶点上形成一层均匀的薄膜，应注意：涂抹的菌量太少，造成分析信号不足，导致鉴定失败；涂抹菌量过多或涂布不均匀，也可导致无法鉴定。在涂布时应尽量覆盖整个靶点区域，超出靶点区域易造成交叉污染^[31]。

在涂布靶板时，还应特别关注以下的特殊菌落。

1．黏液型菌落：

MALDI-TOFMS鉴定微生物主要检测胞内核糖体蛋白，而黏液性细菌因胞外黏多糖形成的荚膜稀释了涂抹到靶位上的菌体浓度，可能导致鉴定失败。针对黏液性细菌，可以采用以下方法提升鉴定效果^[31]：（1）用接种环将黏液性细菌菌落混合均匀，再挑取部分样品进行点板；（2）用棉签轻轻拂去菌落表面黏液，再挑取部分下层样品进行点板；（3）用接种环挑取分纯菌落到装有300 μl去离子水的EP管中，充分分散清洗，16 000~19 000×g，离心2min，弃上清，取沉淀点板。

2．干燥型菌落：

菌落表面粗糙、干燥，有时呈颗粒状，不易挑取和在靶板上均匀涂抹，对于此类菌落应注意避免挑到培养基成分，尽可能在菌落生长早期较疏松时挑取，可尝试在试管内使用甲酸进行提取后再涂靶板。

（三）预防操作污染

在对每株细菌进行前处理时，必须保证相应的耗材洁净无污染，用于涂布靶板的一次性接种环、竹签等工具不能重复使用。同样，滴加基质液或甲酸的移液器吸头在每次涂完一个靶点后必须弃去另换新吸头，避免通过基质液造成的携带污染。

（四）操作安全

在使用MALDI-TOF MS进行微生物鉴定的过程中，从样本处理至结果报告，既要满足生物安全防护要求，也要依照化学危险品管理，保护操作人员和环境安全。

1．生物危害：

使用MALDI-TOF MS鉴定微生物，样本的接收、操作、处理都应符合本实验室Ⅱ级实验室生物安全要求^[32]。在鉴定分枝杆菌、双相真菌，以及疑似高致病病原菌时，实验室需使用厂家提供的并已验证有效的灭活方法^[31,33]充分灭活后提取蛋白^[37]。

2．化学危害：

使用MALDI-TOF MS鉴定微生物时，前处理涉及的化学试剂包括：基质α-氰-4-羟基肉桂酸、乙腈、乙醇、甲酸以及三氟乙酸^[31]，实验室应按照规程使用和存储试剂。需佩戴手套，穿着工作服。

但在操作甲酸、乙腈提取法或靶板清洗（可重复使用的靶板）等步骤时，需使用乙腈或三氟乙酸等有机溶剂，建议在通风柜或生物安全柜中进行操作，并佩戴防护手套和口罩等。

根据《全自动快速生物质谱检测系统IVD MALDI Biotyper 2.3用户培训手册》和《VITEK MS工作流程用户手册》，在完成靶板涂菌后，待干燥后30 min内加基质液覆盖，当细菌和基质液在靶板上自然风干形成共结晶后，即可将靶板上机检测。提示：不能用其他加热方式加速干燥过程。如有需要，准备好的靶板在上机前可于常温下避光放置一段时间，可放置的时间长短，应参考制造商的操作要求。

（一）定标校准

每批次对样本检测前，应首先对定标品进行分析，以检查关键的仪器参数是否调整到了最佳检测状态，定标通过后才能进行样本的分析。现有的可选定标品包括：ATCC标准菌株（如大肠埃希菌ATCC8739）或细菌检测标准品（Bacteria Test Standard, BTS），具体定标品及使用方式仍须参考制造商的操作标准。

MALDI-TOFMS需定期进行仪器校准，避免仪器出现质量轴偏移导致不可靠的鉴定或无鉴定结果出现。原则上讲，质量轴校准应由厂家工程师或经过培训的工作人员操作，应严格按照厂家提供的标准流程进行。

MALDI-TOFMS校准的基本要求包括：定标品样品的分子量范围应覆盖细菌鉴定检测范围（相对分子质量：2 000~20 000）的60%以上，不同系统依厂家所用标准品，如：用细菌检测标准品（BTS）检测8个校准峰，至少应有6个以上得到指认；或大肠埃希菌ATCC8739检测12个标准峰，至少应有8个以上得到指认，且误差在仪器允许的范围之内。当定标品图谱质量差、找不到足够的校准峰或指认校准峰后误差过大，应重复实验或联系厂家工程师解决。

（二）靶板的载入

水分进入真空系统可损坏仪器，需待靶板完全干燥后，方可将靶板载入真空仓。在装载或取出靶板的过程中应穿戴无粉乳胶手套。

（三）图谱的获取

真空系统达到操作压力时，即可进行图谱的获取。图谱获取由系统按照标准采集路径进行，如果使用手工采集，应获取足够多的图谱数据后再进行分析。

为了确保临床鉴定结果的可靠性，MALDI-TOF MS得到的鉴定结果在报告之前，应由微生物专业人员进行审核，审核过程中可结合样本来源、染色结果、形态学、培养条件等特征对结果的准确性进行评判，对于可疑结果进行二次鉴定或增加辅助实验，如果出现不一致的结果，应及时排查原因，给出合理解释。由于不同的MALDI-TOF MS系统结果的判读方式并不相同，以下仅以市场上使用较多的两种结果报告和解释为例进行说明，对于其他的MALDI-TOF MS系统，可参考厂家的操作说明书。

（一）质谱仪鉴定结果为分值和一致性的报告解释

鉴定结果以分值和一致性表示的质谱仪（见《全自动快速生物质谱检测系统IVD MALDI Biotyper 2.3用户培训手册》），除单一种水平鉴定结果显示以外，在报告中同时给出株水平10个参考结果及其一致性分析（以A、B、C表示），其结果可根据表3中原则进行报告。

表3 质谱仪鉴定结果为分值和一致性表示的报告基本分类

1．当得到高置信度（≥2.000分，绿色）的鉴定结果时，应注意检查一致性，排除是否存在混合菌的情况，确定是否需要进行补充或重复实验。当得到低置信度（1.700~2.000分，黄色）的鉴定结果时，可综合排名前10位参考结果报告菌属结果，如必须得到种水平准确鉴定结果，需再进行重复或补充实验。

2．无鉴定结果/图谱无峰时（<1.700分或<0，红色）应检查图谱质量、样本制备流程及仪器状态，可根据表4进行问题排查，选择重新测试或选择其他鉴定方法进行鉴定。

表4 常见问题原因及处理方法

3．验证不成功：检查BTS（细菌检测标准品）是否合格或正确制备，可退靶在干净的空靶位上重新制备BTS位点进行验证。如还不成功，应进行设备的检修和维护。

（二）质谱仪鉴定结果为概率的报告解释

根据《VITEK MS工作流程用户手册》，数据库针对每种可鉴定菌种收集了不同来源的已知菌株建立图谱数据库，所有菌株在不同的测试条件（如培养条件、操作人员及生长时间等）下进行了图谱收集。根据每个菌种的特异性，分别为每个蛋白峰强度指定一个权重，作为鉴定过程的一部分，软件将所获质谱与每个可鉴定菌种定义的峰值权重对比，计算一个量化值，即置信度，表示待检菌与数据库中的每种菌或菌群之间的相似性；然后根据预设的统计学阈值保留最接近的菌种或菌群结果。结果报告分类见表5。

表5 质谱仪鉴定结果以概率为报告的基本分类

1．好的单一鉴定结果（绿色），可信度60.0%~99.9%：可直接报告；但对于带有"!"的重要致病菌，需用其他方法确认后才可报告。如：当系统将鉴定结果报告为B. anthracis（炭疽芽孢杆菌）或Y. pestis（鼠疫耶尔森菌）时，须报告疾控部门进行确认。

2．低分辨结果（黄色），报告2~4个鉴定选项，可能的原因如下：（1）假低分辨：建库时2~3种菌特征太相近，因数据库本身低分辨而无法区别，如阴沟肠杆菌和阿氏肠杆菌，结果显示各50%可信度，无需重新检测，只需用补充实验在这两个结果中进行鉴别区分。（2）真低分辨：可能存在混合菌、质谱特异性峰缺失或多余，造成与数据库中多个菌匹配；也可能数据库中没有该菌而匹配上近似菌。建议检查培养平板菌落纯度和形态后重新检测，如问题依旧，则需要做补充试验或用其他方法鉴定。

3．鉴定失败，无鉴定结果（红色）：（1）定标未通过：可能由于校准点位的定标菌株涂布质量不高导致，建议用新鲜的校准菌株（ATCC8739）重新涂靶板，或微调仪器参数；（2）图谱获取成功，但可用的波峰数量太少，不足以进行分析运算，建议重新获取图谱；（3）待检测菌不在数据库中，建议用其他方法鉴定。

当某些单个鉴定分类条目由多个菌种组成，使用"/"隔开，如Streptococcusmitis/Streptococcus oralis（缓症链球菌/口腔链球菌），出现这一情况的原因是：这两种细菌都是属于缓症链球菌群，高度同源，目前质谱尚不能区分。这两种草绿色链球菌可引起菌血症、心内膜炎，新生儿脑膜炎等，缓症链球菌引起的感染更常见，临床上区分这两种细菌的意义并不显著，不影响药敏试验的报告。

（三）常见问题原因及处理方法

对于中等置信度或低分辨鉴定水平以下的情况，常见的问题如：出现多个鉴定结果、图谱质量差或无峰、鉴定分值低，可能的原因很多，总的来说还是前面提到的问题，包括：样本处理不好、菌落未分纯、操作交叉污染、质量轴偏移、数据库局限等原因。当找到原因后，依据表4推荐的解决方法，包括：分纯菌落，重配试剂，重新按标准操作流程鉴定，对于质谱仪不能鉴别的菌株，还要额外补充试验进一步鉴别，满足某些病原微生物必须鉴定到种的要求。

（一）总体原则

MALDI-TOFMS的应用大幅度扩展了可鉴定微生物的种类和范围，并将更多的微生物鉴定到种甚至亚种的水平。然而实验室的原则是报告具有临床意义的分离菌，何时应该发送精确的分类结果，何时应报告更宽泛的分类结果，应依据实验室内部的报告规程进行。否则，将导致不必要的药物敏感试验及抗生素的过度治疗^[31]。因此，报告前需要综合评估以下因素：样本的分离部位（无菌部位或有定植的部位），获取样本的方式（侵入性或非侵入性），样本质量，宿主因素（免疫状态，病史，感染部位的其他干扰物质等）。

（二）鉴定水平的报告

1．当MALDI-TOF MS能够给出单个高置信的鉴定结果时，通常认为是具有诊断价值的结果，无需进一步确认。

2．对于某些MALDI-TOF MS不易区分的菌种，可能给出多个鉴定结果。当结果为不同的菌属时，需补充试验以确定其正确的菌属范围；当鉴定结果是同一菌属内的不同种，应从临床角度考虑是否需要报告到种水平。举例说明：（1）无菌部位的分离菌具有临床意义，必要时需补充试验鉴定到种水平。（2）有定植菌来源的标本，如从痰液中分离菌株的鉴定出现多个肠球菌属的结果时，则无需进一步鉴定；从伤口培养物中，将凝固酶阴性葡萄球菌报告到种水平则几乎没有作用（除外路邓葡萄球菌），可能会导致不必要的抗生素治疗。（3）如从一个病人两套血培养中分离出"凝固酶阴性葡萄球菌"，可能是污染，也可能是真正的致病菌。如果一套血培养分离表皮葡萄球菌，另一套分离出人葡萄球菌，则能够基本确定是污染；而如果两套血培养均报告沃氏葡萄球菌，结合临床的高危因素则能够预示真正的感染[31]。

3．如果鉴定结果到属水平，则需要根据临床意义判断是否有必要进一步鉴定到种，并进行相应的补充检测。某些微生物必须总是报告到种/亚种水平，包括（但不限于）：（1）具有潜在致病力，如溃疡棒状杆菌、路邓葡萄球菌、假中间葡萄球菌、化脓隐秘杆菌；（2）公共健康相关的微生物，如白喉棒状杆菌；（3）某些通常对常规经验用药具有耐药性的微生物，如克柔念珠菌；（4）与某些疾病高度相关的微生物，如已被证实与胃肠道肿瘤相关的解没食子酸链球菌解没食子酸亚种^[31]。

（三）飞行质谱仪鉴定的局限性

当以基因测序作为参比方法进行对比时，MALDI-TOF MS的鉴定能力要强于传统的生化鉴定方法，但不同的MALDI-TOFMS系统在鉴定性能上可能表现出不同程度的差异，主要取决于系统数据库的完整程度和质量，包括菌种的覆盖、每种菌所用的建库菌株数量和来源、以及图谱采集的质量。实验室必须对使用仪器的局限性有充分的了解，包括哪些特定的近缘菌种不能区分，并在必要时进行补充试验，这些局限性随着数据库的不断扩展和计算方法的改善可能会逐步缩小^[31]。目前已知的在MALDI-TOF MS系统上存在的一些局限性见表6，具体各个型号仪器的局限性仍然需要参考相应的产品说明书。

表6 MALDI-TOFMS系统上可能存在的局限性和解决方法

（一）性能验证

性能验证是证明MALDI-TOF MS系统在本实验室的表现符合制造商说明文件中的性能参数要求，并能够满足实验室的临床检测需要。

性能验证应包括准确性验证和重复性验证两个方面^[31,34]。准确性验证是使用质谱仪对实验室常见微生物进行鉴定（应覆盖实验室常测不同类型菌种的80%~90%，反映患者群体的多样性^[31]及具有特殊临床意义的细菌），其鉴定结果与参比方法的结果比对，准确性应达到90%~95%或以上。重复性验证则是证明质谱仪对不同批次、不同操作人员、不同时间鉴定结果具有重复性。实验室在引入新的鉴定系统或者更换新软件时都应该进行完整的性能验证，而在升级数据库、增加鉴定类型或更换仪器配件后仅需对受影响的范围进行验证即可^[31]。性能验证方案可参见"MALDI-TOF MS病原体鉴定质量保证专家共识"相关部分^[37]。

（二）质量控制

除了在样本检测前进行定标校准外，实验室应根据厂家建议或相关规范，设置包括阳性对照、阴性对照的室内质量控制程序^[31,34]，以证明质谱仪器性能良好、试剂有效、样本处理方法合理、人员操作规范等。

1．阳性质控：

阳性对照应设置有临床代表性的标准菌株，阳性质控菌株的选择应根据实验室的检测范围进行，一般包括至少一株细菌和一株有代表性的酵母样真菌；如果需要进行分枝杆菌/丝状真菌的鉴定，同样需要选择相应的质控菌株，质控菌株的检测应保证完全按照患者样本的检测条件进行，包括样本的前处理方式^[37]。阳性质控预期应以全部质控菌株获得唯一且高置信度的正确鉴定结果为标准。

2．阴性质控：

阴性对照应采用除菌株外的实验相关试剂（如甲酸和基质溶液）以证明试剂和靶板（若使用重复利用靶板）未发生污染，有效避免假阳性结果。阴性质控结果应以没有任何可检测的波峰为标准。对于重复使用的靶板，每次鉴定的阴性对照可选择不同位点，以证明靶板不同区域清洗彻底无污染。阴性质控结果应以没有任何可检测的波峰为标准，每次鉴定的阴性对照可选择不同位点，以证明靶板不同区域清洗彻底无污染。

3．质控频率：

阳性质控和阴性质控应与每日检测的标本同时进行，并将每日的质控结果进行记录。在失控期间，应暂停使用系统进行常规临床样本的检测，直至找出问题的原因，解决后通过质控[31]。

（三）质谱仪的日常维护

质谱仪在执行微生物鉴定时，每个环节都有可能对最终鉴定结果产生影响，因此需对检测全过程进行监测和控制。表7中列举了MALDI-TOF MS仪器使用过程中涉及的日常维护内容及标准。实验室需建立良好的使用管理规范，对于维护仪器良好状态，保证质控结果，确保仪器鉴定准确性和及时性具有重要意义。

表7 MALDI-TOFMS日常维护内容及标准

综上所述，MALDI-TOF MS为微生物鉴定提供了一个强有力的工具，但实现微生物质谱仪的操作标准化，是需要从检验前（培养物准备）、检验过程（样本前处理及分析）、检验后（结果的解读和报告）以及常规问题排查、质量控制、生物安全、日常维护等多个方面做到标准化的。只有在日常工作中严格执行这些要求，才能保证获得高度可信、并且具有临床价值的检验结果。此外，MALDI-TOF MS数据库的定期更新也将不断提升实验室的鉴定能力和鉴定水平。微生物专业人员应当充分地理解和运用好这一工具，更好地为临床诊疗服务。本共识对目前临床应用环节中出现的主要问题作了归纳和总结，希望能够对使用者的实际工作提供相应的规范化指导。

选自中华检验医学杂志,2019,42(4)