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自身抗体(autoantibody)是指针对自身组织、器官、细胞、细胞亚结构、体内蛋白分子等所有自身抗原的抗体总称[1]，其本质为机体B细胞分泌的免疫球蛋白[2]。自身抗体分为生理性自身抗体(或称天然自身抗体)和病理性自身抗体[3]，后者即为通常讲的自身抗体[4]。据报道，目前发现的自身抗体达数百种[5]，目前临床常规检测自身抗体项目约80种，主要包括抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)及其抗体谱、抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophilcytoplasmic antibody，ANCA)及其抗体谱、抗磷脂抗体谱、自身免疫肝病抗体谱及肌炎抗体谱等。近年来，随着抗体筛选技术的应用，越来越多的自身抗体被发现，应用范围除自身免疫性疾病外，已拓展至消化、生殖及肿瘤等领域[6]。自身抗体检测种类及数量爆发式增长，自身抗体检测市场欣欣向荣，但同时也带来不少问题，现对自身抗体检测的问题和对策作一探讨。
一、自身抗体相关概念 自身抗体相关概念问题包括自身抗体命名及其检测方法两个方面。
1．自身抗体命名： 自身抗体命名并无专门机构统一管理，而由各学者自由发挥，如对于传统的抗SSA抗体，其本质为干燥综合征(sjögren syndrome，SS)患者发现的第一个抗体。随着抗原重组纯化技术的发展，可检测到抗SSA抗体的两个亚单位，即抗SSA/Ro60抗体和抗SSA/Ro52抗体，两种抗体与SS的关系如何？临床出具的报告为抗SSA抗体，其具体指那种？这给临床医生造成极大的困惑，实际上传统的抗SSA抗体即指抗Ro60抗体，而抗Ro52抗体与SS没有太大关系[7]。再如，ANA谱及ENA抗体谱的概念问题，ANA谱是指针对明确纯化抗原抗体的集合，其与传统的ENA抗体谱有所不同，传统ENA抗体谱检测通常采用磷酸盐缓冲液提取动物胸腺细胞核蛋白作为抗原底物[8]。但由于核成分中的DNA和组蛋白等碱性成分无法被磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)提取，因此，传统ENA抗体谱并未包括抗DNA和抗组蛋白抗体。而目前，仍有很多学术文章、专著及检验报告等均会出现两者概念混淆的情况。对于这种问题应由专业学术委员会及时对易造成困惑的问题进行澄清和宣讲，以提高学术界的统一认识。还有，目前临床上检测的ANCA，由于杂志社或出版社的要求，将"胞浆"统一为"胞质"，因此，该抗体具有抗中性粒细胞胞浆抗体和抗中性粒细胞胞质抗体两种命名[9,10]，这种命名差异也给临床医生和研究学者造成混乱，部分学者仍在质疑这两个抗体是否为同一种物质。对于这种命名修改应做一定的调查，以大家统一的认知度为准，然后再确定是否需要修改。
2．自身抗体检测方法命名： 自身抗体检测方法越来越多，近年来出现了流式荧光法和化学发光法等新型检测方法。不可否认，试剂生产商推广的检测方法和产品将带动自身抗体学科的发展。但在一定条件下，出现了试剂生产商引领学科发展，有时对学科造成很大混乱，如：流式荧光法、悬浮芯片法、multiplex法、液相芯片技术、多元流式点阵仪等，其实质这些方法大同小异；另外如免疫印迹法、线性印迹法或免疫斑点法等，这些方法也是相同的，由于专家学术认知不同，这些大同小异的方法却按不同方法写入了专著或教材，其负面影响更深远。行业协会及出版社应该为此负起审核责任，避免学术混乱。
二、自身抗体标准溯源 自身抗体必须采用相应的靶抗原进行免疫结合反应进行检测，即抗体针对的靶抗原才是核心，因此自身抗体检测结果与靶抗原的序列、肽段三级或四级结构，抗原决定簇暴露位置等有关。不同抗原生产商靶抗原结构会有一定的差异，特别是对于专利保护的抗原，试剂生产商为了避开专利，对抗原进行重新设计和改造，合成新的抗原，若该抗原决定簇与其他抗原不同或不完全相同，就会造成检测结果不相符。如，抗心磷脂抗体检测对于狼疮和病态妊娠的诊断具有重要价值，但同一患者不同医院检测结果迥异，临床医生不知该如何处理。此外，由于很多试剂生产商购买第三方的抗原原料进行包被加工，出于商业秘密原因，很多试剂厂商不会告知抗原来源或抗原序列，这为真正的结果判断带来障碍。对于活细胞的标准化溯源更为困难，临床上推荐采用HEp-2细胞底物进行ANA检测，由于细胞固定前是培养的活细胞株，对于同一批号的活细胞存在不同生长周期的细胞，因此，同一底物片中的细胞各不相同。而对于不同试剂生产商而言，其细胞差别会更大，更何况有些细胞进行了改造，如将HEp-2细胞中导入SSA抗原，以增强检测抗SSA抗体的能力，这种细胞称为HEp-2000细胞，其与传统的HEp-2细胞具有较大差别[11]。
目前，自身抗体检测无溯源标准是行业共认的难题。目前国内仅有抗甲状腺球蛋白抗体等少数自身抗体能购买到相关的标准品，国外学者也认识到自身抗体检测标准化问题，已有Diana等[12]学者对抗促甲状腺受体抗体进行标准化比对研究，以尽量实现结果可比性。但对于大多数抗体并无标准品可以参考，目前我国临床上通常采用市场占有率高及信誉度高的试剂作为标准，但实际上，上述标准未必是真正的标准，甚至可能误导临床，比较合适的方法应该是以临床诊断患者为标准，以较高的临床诊断灵敏度和特异性作为试剂评判标准可能是一种目前不得以而求其次的办法。
三、自身抗体检测方法选择 目前，自身抗体检测方法多，主要以荧光法、印迹法及ELISA法为主。以ANA检测为例，HEp-2细胞为底物的间接免疫荧光法是推荐检测方法，但并非所谓的"金标准"方法。而ANA谱通常采用以纯化抗原的免疫印迹法或ELISA法进行检测。有很多文献认为前者为筛选性实验，而后者为确证性实验，实际上这种说法欠妥。既然间接免疫荧光法检测ANA是筛选性实验，那该方法应将所有相关抗体全部检测出来，但实际并非如此，荧光法ANA为阴性但ANA谱[如抗Ro60抗体和(或)抗Jo-1抗体等]可出现阳性，更不能以荧光法检测ANA阴性，即认为ANA谱必为阴性，截至目前也有不少论文表明ANA和ANA谱同时检测的必要性[13]。此外，将ANA谱称为确诊性实验也不妥，确诊性实验的含义是指该实验方法能将标本中的抗体检测出来并一定会检测出来，但鉴于抗原结合位点及检测敏感度的问题，任何人都无法保证能将真正的抗体全部检测出来，因此，在临床上避免使用这两个容易引起误解的词汇。 目前自身抗体检测多为定性或半定量的方法，定量高敏的检测方法是自身抗体发展的方向。对于目前出现的两种检测方法，即多个自身抗体同时检测(也可单个检测)的流式荧光法[14]和单项自身抗体检测的化学发光法[15]该如何选择？两种检测方法均为高精度、全自动化大型检测仪器，但其各具特点，前者一次检测项目最多达100多项，但其必须组套项目同时检测，对于初诊患者而言，确实可以通过多个疾病的自身抗体组套，可以很快检测出相关疾病的自身抗体，当然其检测费用较高，但可以节约诊断时间；对于确诊患者，通常只需要检测曾经检测出的阳性的几个自身抗体即可，这对于流式荧光法而言，多项检测将造成资源浪费。因此，试剂仪器生产商将会对检测技术及检测成本进行竞争，让临床能够得到更多更好的选择。
四、自身抗体检测的标准化 准确的结果不仅取决于临床检验过程，与试剂生产过程也密切相关。严格来讲，自身抗体检测的标准化包括试剂生产、标本检测及报告审核等全过程。但由于试剂生产和临床检测由不同部门监管，因此，此处只讨论实验室检测的标准化。所谓标准化，即对相关操作要求均有严格的规定，但对自身抗体的临床检测，其标准化要求显得比较宽容，但这对于临床检测却是很大的问题。
1．滴度系统： 目前部分自身抗体检测结果采用滴度高低表示，滴度越高表明患者体内自身抗体浓度越高。以ANA检测为例，目前采用以HEp-2细胞为底物的间接免疫荧光法进行检测，但血清起始稀释度却各不相同，如1∶80或1∶100等，而且国内有两种滴度体系，即倍比滴度体系(1∶80、1∶160、1∶320、1∶640…)[16]和
2．反应温度： 温度是影响免疫学反应的重要因素。不同的温度将会导致结果出现较大的差异。很多实验室采用手工检测进行自身抗体检测，即使采用仪器，反应环境也是裸露于室温当中。目前很多试剂盒说明书均要求在"室温"条件下反应，这种弹性要求给自身抗体检测埋下隐患。在实际情况下室温变化很大，不同地区间的室温差别更大，对于这一问题，应从几个方面解决，首先，试剂说明书应规定在确定的温度下进行，但对于裸露的试剂和仪器具体具有挑战性，要求维持房间恒温可能不现实，比较可行的方法是实验室可以进行不同温度下的ANA结果差异研究，从而调整不同温度时的温育时间，通过性能验证找到温度差异及时间差异的平衡点，从而制定适合自身条件变化的标准化操作规程(standard operating procedure，SOP)，严格遵循SOP进行日常操作，以减小因温度差异造成的结果差异。
3．反应时间： 时间是影响免疫学反应的另一重要因素。临床实践中，很多实验室对于反应时间这一要求的执行并不严格。以ANA检测为例，若采用手工加样检测，加样第一点及最后一点反应时间本身已有差别，第一点反应时间等于最后一点反应时间加上加样持续时间，对于加样较慢的技术人员，这种影响其实并不小。因此，对于检测仪器而言，最好设计采取每反应区均有相同的反应时间，保证每反应区的反应条件的均一性。这种反应时间执行不严格还表现在补加荧光标记抗体上。在临床实践中，偶然会出现荧光标记抗体侧漏到反应区外的情况，对于这种情况，很多实验室只是将荧光标记抗体补上去而已，对于荧光标记抗体孵育时间减少了多少并未关注，这将会导致自身抗体滴度下降甚至假阴性。对于这一问题，严格以"非立即补加须进行复查"的原则，以保证检测结果质量。
4．荧光模型判读： 荧光法检测自身抗体包括底物片检测和荧光模型判读两个过程。检测结果受方法、试剂、仪器及实验人员的经验等诸多因素影响外，荧光判读过程的影响其实更大，影响因素包括荧光显微镜的质量，技术人员对图像的认知经验，荧光强度的感知，视力的好坏等。目前已有公司开始采用荧光图像采集，然后通过观察显示器上图像进行结果判读，这也带来新的问题，如各公司图像采集卡的质量和参数不同，显示器分辨率及显卡质量等存在很大差异，同一图像在不条件下可以得出完全不同的结果，这一点值得我们注意。对于上述问题，应分两个阶段解决，第一阶段，由于各家实验室的荧光显微镜、图像采集卡、显示器及读片人员均有所不同，之间的差异会比较大，行业协会可以采用发放不同荧光模型不同滴度梯度的血清作为结果校准标准，以此为标准制作各实验室条件下的荧光图像模型及滴度标准，这样可以消除硬件及人为主观因素之间的差异，最后实现同一血清无论那家实验室检测结果均在相同的滴度区间，当然荧光模型越多越全越好。
五、自身抗体项目选择及应用 近年来，自身抗体检测的进展迅速，抗体种类繁多，应用领域不断扩大。但临床应用过程中，自身抗体项目选择及应用存在一些问题。对于大部分自身抗体而言，对于疾病诊断敏感度不高，即不是所有患者都能检测到相应的自身抗体；特异度也不好，即不是所有阳性抗体均能且只能诊断某一种疾病。很多自身抗体的应用共识是：只有患者怀疑某种疾病时才检测相应的自身抗体，阳性结果对于疾病诊断具有辅助诊断价值，阴性结果则不能排除诊断。临床实践中，商家将太多的自身抗体组合在一起，特别是线性免疫印迹条带，一人份试剂条可以组套20多个不同的自身抗体项目，很多情况下，这种组套对于患者而言并不是每个指标都有价值，从而浪费大量的医疗资源，实际上，在一定程度上是试剂规格和项目组合绑架了医保制度。对于这一问题，试剂厂商应尽量将检验项目单独分装，若需要组套也应以疾病相关抗体组合在一起，组合项目越少越好。这种作法，对于实验室检测而言可能会增加一定工作量，但从国家整体而言，可以节约大量的医保经费支出。
来源: 中华检验医学杂志
我有话说......
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