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基因筛查在早期识别新生儿WAS基因相关疾病中的临床应用

面气灵 2019-7-12 10:13 AM 1377人围观 医学


摘要

目的

探讨基因筛查用于早期识别新生儿WAS基因相关疾病的临床应用价值。


方法

2016年1月至2017年12月复旦大学附属儿科医院新生儿基因组计划纳入新生儿重症监护病房中的5 800例高危新生儿,采用高通量测序方法进行遗传病因的分析,检测到的11例携带WAS基因致病或可疑致病变异的新生儿。回顾性总结11例患儿(均为男性)临床特征,并结合基因变异特征,进行表型基因型分析。


结果

11例患儿中5例为湿疹-血小板减少-免疫缺陷综合征(WAS),6例为X连锁血小板减少症(XLT)。WAS患儿中2例在新生儿早期、3例在5~8周龄出现临床表现。3例XLT新生儿因其他疾病住院治疗,发现血小板减低。检测到WAS基因致病或可疑致病变异11个,其中7个为首次报道的致病或可疑致病变异,包括2个移码变异c.138delG和c.388_390del,4个剪接位点变异c.1453+1G>A、c.734+1G>C、c.135G>A和c.1453+3G>C,1个错义变异c.1118C>T。另外4个已报道致病变异是c.777+1G>A、c.107_108delTT、c.436delC和c.1509_*3delAGTG。3例患儿接受了造血干细胞移植治疗,2例治愈。


结论

WAS基因相关疾病在新生儿期缺乏特征性表现,新生儿期基因筛查有助于早期识别和干预该类疾病。


WAS基因相关疾病是由于WAS基因变异所致的一类原发性免疫缺陷病。根据临床表现可分为Wiskott-Aldrich综合征(Wiskott-Aldrich syndrome,WAS)、X-连锁血小板减少症(X-linked thrombocytopenia,XLT)、间歇性X-连锁血小板减少症(intermittent X-linked thrombocytopenia,IXLT)和X-连锁中性粒细胞减少症(X-linked neutropenia,XLN),均为X连锁隐性遗传。其中WAS是最常见的临床类型,WAS又称湿疹、血小板减少伴免疫缺陷综合征,以湿疹、血小板减少伴体积减小、反复感染、易合并自身免疫性疾病及恶性肿瘤为特征,因最先由Alfred Wiskott和Robert Aldrich发现而命名[1],发病率占出生男孩(1~10)/1 000 000[2]。该病发病年龄早,多发于新生儿期,绝大多数起病于6月龄内[3]。1994年,Derry等[4]通过定位克隆技术明确WAS基因变异为该病的根本原因。由于WAS基因变异所致疾病的临床表现差异大,很多患儿虽然起病年龄早,但诊断年龄滞后,平均确诊年龄为10.8月龄,严重影响患儿的预后。WAS患儿若不经造血干细胞移植治疗其生存期仅为15年[5],因此,早期诊断是改善预后的关键因素。为探讨早期诊断WAS基因相关疾病的方法,2016至2017年对参与新生儿基因组计划的患儿进行了回顾性分析,旨在探讨基因筛查用于早期识别新生儿WAS基因相关疾病的临床应用价值。


对象和方法

一、研究对象

新生儿基因组计划以新生儿重症监护病房(neonatel intensive care unit,NICU)住院患儿为研究对象,于2016年1月在复旦大学附属儿科医院开始实施,于2016年6月开始在协作单位实施。本研究经复旦大学附属儿科医院伦理委员会批准,批准号为复儿伦审(2016)018号,并获得家长知情同意。


基因组计划纳入至2017年12月31日NICU中的5 800例高危新生儿,采用高通量测序方法进行遗传病因的分析。纳入标准:(1)NICU住院患儿;(2)多系统器官畸形;(3)常规治疗效果不佳,如感染、血小板减少、抽搐等;(4)存在无法用常见疾病解释的症状。排除标准:(1)单纯因早产入住NICU者;(2)无法取得家长知情同意者。


本研究为回顾性研究,仅总结分析高通量测序检测到WAS基因致病变异或可疑致病变异的11例男性新生儿患儿。致病或疑似致病变异为符合以下条件中的一个:(1)已经被报道为致病变异,并且既往报道该变异导致疾病的表型和患儿的临床表型相符;(2)未报道过的新变异,但变异类型为对功能影响较大的有害变异,包括无义变异、终止密码变异、起始密码子变异、移码变异和剪接供体或受体变异;(3)在家系内验证结果符合遗传模式的,未报道过的新的错义变异,且变异在公共数据库及内部数据库中,无正常男性携带。


二、方法

1.临床资料:

收集患儿的发病年龄、性别、诊断年龄、初发症状、临床表现、治疗及预后情况。参照WAS基因相关疾病临床表型评分标准进行分型[6],1分为仅有血小板减少和血小板体积减小,不伴任何其他临床表现;2分为血小板异常,伴轻度或短暂湿疹,伴或不伴轻度感染;3分为血小板异常,伴持续可控的湿疹和(或)反复可控的感染;4分为血小板异常,伴严重、难以控制的湿疹及反复重症感染;5分:除血小板异常、湿疹和(或)反复感染外,发生自身免疫性疾病和(或)恶性肿瘤。评分低于1分纳入IXLT,1~2分归入XLT,3~4分为WAS,发生自身免疫性疾病和(或)肿瘤均评为5分,XLN不评分。


2.高通量测序分析:

采用美国Qiagen公司微量全血试剂盒提取基因组DNA,参照美国Agilent公司人类全外显子组捕获试剂盒说明书构建文库。采用美国Illumina公司HiSeq2000测序平台进行序列检测。经图像识别、去除污染及接头序列后的数据以人类基因组hg19(GRCh37)为参考序列进行比对,生成初步分析数据,采用GATK软件v.3.2.2进行变异分析。对变异基因区域等进行注释、变异致病性及频率比对、错义变异功能评估预测。依据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)标准对变异进行评级分类。


3.WAS蛋白表达检测:

取患儿、患儿母亲外周血各1 ml,分离外周血单个核细胞,采用流式细胞仪(BD FACSCalibur,美国)检测WAS蛋白表达(WAS蛋白抗体购买自美国BD公司),FlowJo软件进行数据分析。


三、统计学处理

计量资料用均数(范围)描述。


结果

1.一般临床资料:

11例携带WAS基因致病变异患儿均为男性,其中8例因血小板减少入组新生儿基因组计划,3例因其他疾病入组新生儿基因组计划。11例患儿均无明确血液系统疾病、遗传疾病家族史。8例患儿起病于生后第1周,但其中3例就诊原因为其他疾病,入院后发现血小板减少,3例患儿起病于5~8周龄。根据临床评分诊断标准,5例诊断为WAS,6例为XLT。与WAS基因相关的首发症状包括消化道出血(4例)、皮肤出血点(4例)、湿疹(1例),其中1例首发症状同时包括颜面出血点和消化道出血。WAS基因相关疾病临床表型评分1分3例,2分3例,3分4例,4分1例,详细临床表型见表1。11例患儿均反复发生不同程度血小板数量及体积减少,平均血小板数目为32.3×109/L,范围为(5~57)×109/L,平均血小板容积为9.7 fl,范围为8~12 fl。WAS患儿血小板的平均水平低于XLT患儿。WAS患儿在接受治疗过程中血小板数目一直处于波动状态,其中3例患儿接受造血干细胞移植治疗,只有1例患儿血小板水平恢复正常;XLT患儿在接受治疗后均有不同程度好转,3例恢复到正常水平。10例完成常规免疫功能评估(淋巴细胞亚群和免疫球蛋白)的患儿,淋巴细胞亚群和免疫球蛋白均无明显异常。11例患儿均未出现肾病表现。


2.WAS基因致病或可疑致病变异:

全外显子测序共发现11个基因致病或可疑致病变异,包括已报道的4种致病变异,其中1个为既往报道的热点致病变异(c.777+1G>A),3个为移码变异c.107_108delTT、c.436delC和c.1509_*3delAGTG;另外7个为新发变异,包括2个移码变异c.138delG和c.388_390del,4个剪接位点变异c.1453+1G>A、c.734+1G>C、c.135G>A和c.1453+3G>C,1个错义变异c.1118C>T(表1)。4例患儿通过家系验证,发现母亲为致病变异携带者。5例WAS患儿的变异类型包括2个移码变异和3个剪接位点变异。


3.WAS蛋白表达水平:

仅有4例临床表现典型的患儿进行了WAS蛋白检测,其中3例患儿不表达,评分均为3分;1例患儿表达减少,评分为4分。


4.临床干预及预后:

(1)3例WAS患儿接受了造血干细胞移植治疗,均携带WAS基因的有害变异,即2个+1位的剪接位点变异,1个移码变异。其中1例于1岁接受移植,移植后出现反复感染,因脓毒性休克及多器官功能障碍综合征死亡;1例患儿于122日龄接受移植,术前发生支原体感染,术后发生肺部感染,4个月后发生巨细胞病毒感染和移植物抗宿主反应,经治疗好转;1例患儿于1岁3月龄接受移植,未发生移植物抗宿主病,血小板恢复正常水平。(2)6例XLT患儿中,3例患儿分别因"呼吸窘迫综合征""胎粪吸入性肺炎""新生儿高胆红素血症"就诊,入院后发现血小板减少,基因检测后诊断,定期接受IVIG支持治疗,继续随访中。其致病变异种类包括3个移码变异,2个剪接位点变异和1个错义变异。


讨论

感染是导致新生儿死亡的重要原因。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)数据显示,全球每年约有400万新生儿死亡,其中近1/3死于感染,感染已成为导致新生儿死亡的第二位因素(仅次于早产及其并发症)[7,8]。新生儿感染之所以死亡率高,除病原因素之外,免疫功能状态是重要影响因素。WAS基因位于X染色体短臂的Xp11.23-p11.22区域,包含12个外显子,编码由502个氨基酸组成的WAS蛋白[9]。WAS蛋白是一种富含脯氨酸的胞质蛋白,表达于各类血细胞和免疫活性细胞,维持各系血细胞生成、迁移以及调节免疫细胞正常活性[10]。WAS基因致病变异会导致WAS蛋白表达异常或缺失,进而影响血小板生成和聚集以及淋巴细胞迁移、信号传导和突触形成。


WAS基因相关疾病多起病于新生儿期,近年来有研究发现表型较重的WAS发病年龄较早(平均0.7月龄),而XLT发病年龄较晚(平均7.07月龄)[3]。湿疹、血小板减少和免疫缺陷是WAS的典型临床特征,但在新生儿期,常缺乏上述典型的三联征。本组11例有明确临床信息的患儿,起病年龄为0~8周龄,8例患儿起病于生后第1周,但其中3例就诊原因为其他疾病,入院后发现血小板减少;3例起病于5~8周龄。且首发的表现特征性不高,包括便血或湿疹或皮肤出血点,故而在疾病早期不足以引起新生儿科医师的重视。本组数据提示,WAS多症状较为严重,但也可在新生儿期后出现相应临床表现。


WAS基因相关疾病不能完全依靠于新生儿期的特征性表现进行临床诊断。目前已知WAS蛋白表达情况和疾病严重程度相关。WAS蛋白阳性患儿(一般表达减少)临床表型较轻为XLT;WAS蛋白阴性患儿(表达缺失或表达截短型WAS蛋白)临床表型较重为WAS[11]。本组4例WAS患儿检测了WAS蛋白表达情况,其中3例患儿蛋白不表达,1例患儿表达降低,支持既往研究结论[11,12]。这4例患儿均携带移码变异和剪接位点变异。对于新生儿期的轻度出血倾向表现,应警惕WAS基因变异的可能,早期通过蛋白水平、基因水平协助早期诊断。


基因筛查有助于早期识别WAS基因相关疾病,为治疗手段的进一步选择和预后判断提供证据。已知的WAS基因致病变异约有300种,包括错义变异、拼接位点变异、缺失变异、无义变异、插入变异及复合变异。本组5例WAS患儿具有较严重的表型,包括血小板减少、湿疹、感染,其余6例XLT患儿表型较轻。11种WAS基因变异包括7个新发变异和4个已知变异(其中1个为热点变异)。与以往报道相比,本组WAS患儿的基因变异情况相似,而XLT患儿的变异种类多样,并且剪接位点变异和移码变异占了大多数。目前报道的基因致病变异类型与疾病表型的关联主要为XLT或表型较轻的疾病多为错义变异,WAS或表型较重的疾病多为无义、缺失、插入、拼接位点变异[13,14]。值得注意的是,在2例患儿的11号外显子上检测到2个位置相近的剪接位点变异c.1453+1G>A和c.1453+3G>C,临床分别诊断为WAS和XLT,其中XLT患儿于5日龄检测到血小板减少,住院1个月余出院,对该患儿应密切随访表型便于尽早治疗。目前造血干细胞移植仍是临床根治WAS最有效的方法。本组3例WAS患儿接受了造血干细胞移植治疗,其中2例病情得到控制。


本研究采用的临床全外显子组测序的方法,在检测的5 800例患儿中,仅WAS基因变异这一种疾病就检出11例,远远超过整个人群的发生率,提示NICU住院患儿为高危人群,有必要进行基因检测,进行尽早干预,即可节省抗感染、生命支持等费用。本数据提示,依靠WAS基因变异的类型,有助于判断临床的分型,对于携带错义变异的患儿,其导致WAS的可能性相对较小。本研究补充丰富了WAS基因的致病变异谱,为临床早期遗传检测、临床干预和治疗WAS基因相关疾病提供了初步依据,也为家系提供遗传咨询,为致病变异携带者进行胚胎植入前诊断、产前检测提供了基础[15]


本研究的不足,一方面由于此类罕见疾病,样本量比较小,需要不断扩充样本量从而形成更加具有说服力的结论;另一方面,需要不断完善新生儿期此类疾病的跟踪随访队列,对于此类遗传相关疾病的后期临床表现进行系统和完善的整理。

参考文献(略)

    

    

原作者: 刘旭 杨琳 王晓川 吴冰冰 王慧君 王宏胜 钱晓文 程国强 曹云 孙金峤 周文浩 来源: 中华儿科杂志
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