检验医学与感染病学（一）——感染性疾病常规检验概述

        作者：黄山

单位：贵州省临床检验中心

感染是病原体以某种传播方式从传染源传播到易感者，并在宿主体内生长繁殖、释放毒素或导致机体内微生态平衡失调的病理生理过程，大多数病原体是由外界侵入的，受病原体侵袭力、致病力及宿主免疫状态等多种因素的影响，其破坏人体内的微生态平衡后机体产生各种不同的感染状态，出现感染性疾病。

为了确定感染的发生及其性质，在疾病早期提供恰当的治疗方案，并采取有效的预防措施，防止感染可能广泛传播所造成的危害，临床上常需进行病原生物学检验。随着广谱抗菌药物的广泛应用甚至滥用，细菌耐药性不断增强。由耐药菌尤其是多重耐药菌引起的感染日趋严重。病原生物学检验也越来越受到重视，感染性疾病的早期诊断对疾病的诊断和治疗至关重要。

细菌、螺旋体、支原体、放线菌、衣原体、立克次体、病毒，真菌、原虫、蠕虫等各种不同病原体所致感染性疾病不同，实验诊断方法亦有区别。首先临床微生物实验室可以通过常规检验在显微镜下直接观察病原体，或采用血清学反应检出病原体抗原成分，或借助分子生物学方法检测病原体核酸，并结合患者的病史、症状或体征作出初步诊断。然后对病原体进一步分离与鉴定以作出明确诊断。正确、规范采集和运送标本非常关键。此外，临床实验室在指导临床选择抗菌药物，制订治疗和监控方案，避免耐药菌株产生等方面也起着重要作用。

由实验技术直接或间接获得病原体及病原体结构成分，是确诊感染性疾病的一个重要依据。临床实验室诊断细菌感染性疾病以分离培养技术为主，诊断病毒性疾病以免疫学方法为主。各种病原体感染后，刺激机休免疫系统产生相应的抗体或释放某线抗原成分，可利用免疫学技术手段进行检测，帮助某些感染性疾病的诊断或早期诊断。

临床常见病原体实验诊断方法有以下几种。

1.不染色标本检查

即采用悬滴法或压滴法，在不染色状态下借助暗视野显微镜或相差显微镜观察病原体的生长、运动方式、螺旋体形态或运动。直接镜检结果对病原学诊断具有一定意义，如脑脊液涂片中查见革兰染色阴性肾形双球菌，结合患者发热、喷射状呕吐、剧烈头痛和脑膜刺激体征，可作出流行性脑脊髓膜炎的诊断。至于某件有正常菌群寄居的腔道分泌物，直接涂片镜检虽不能明确诊断，但对进一步检查的方法和病原体分离鉴定所需培养基的选择有重要提示作用。如米泔水样便的悬滴法动力检查，发现有运动活泼的鱼群样弧菌，常提示弧菌科细菌感染，可进一步用碱性蛋白胨水增菌，分离接种于硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆汁-蔗糖（TCBS）选择培养基。湿式涂片有助于寄生虫虫卵检查。

电子显微镜在临床常规检查中很少应用，但对某些病毒感染有确诊价值，如婴幼儿腹泻，在其粪便中查见车轮状的双层衣壳病毒颗粒即可诊断为轮状病毒感染。

2.染色标本检查

标本直接涂片、干燥、固定后染色，或经离心浓缩集菌，涂片染色，置光学显微镜下观察病原体的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体的特征。

1.感染性细菌的分离培养

根据临床症状、体征和显微镜下检查特征作出病原学初步诊断。根据可疑菌生长培养特性，选择合适的培养基，提供合适的气体条件、温度和pH环境，根据菌落性状（大小、色泽、气味、边缘、光滑度、色素、溶血情况等）和细菌的形态、染色性，检测细菌生化反应结果和血清学试验，对分离菌作出鉴定；也可借助于微量鉴定系统，快速简便鉴定分离菌。在鉴定细菌的同时，需做抗生素药物敏感试验。

2.不能人工培养的感染性病原体

根据不同的检测目的，将标本接种于易感动物、鸡胚或行细胞培养。接种动物后，可根据动物感染范围、动物发病情况及潜伏期，初步推测为某种病原休。接种于鸡胚的病毒，根据不同接种途径的敏感性及所形成的特殊病灶。有助于初步鉴定。细胞培养的病毒，可依据细胞病变的特点或红细胞吸附、干扰现象、血凝特性等缩小病毒的鉴定范围，最后用血清学方法作最后鉴定。

用已知抗体，借助免疫荧光技术、酶免疫技术、化学发光技术、胶乳凝集试验等技术检测标本中未知的病原体抗原，其诊断价值常依标本不同各异。标本中若存在多种正常寄居微生物，可因交叉抗原存在而不能确定诊断。只能在活细胞内增殖的病毒或立克次体、衣原体使用特异性好、效价高的单克隆抗体检测，在设有严格的对照和排除试验时，阳性的结果可作出准确的病原学诊断。

直接分析病原体的特异核酸来诊断感染的可能性，灵敏、快速和准确，具有很好的发展前景。核酸检测适用于目前尚不能分离培养或很难分离培养的微生物。随着探针标记技术的不断改进，检测试剂盒的商品化，操作更简便易行，在临床病原体实验诊断中广泛应用。核酸检测技术主要有聚合酶链反应（PCR）、DNA探针杂交技术、基因芯片技术和序列分析等。

1.PCR

将待检标本经细胞裂解液裂解后，在加有引物、四种三磷酸核苷、TaqDNA聚合酶和含Mg2+缓冲体系中，经变性、退火、延伸。在不同反应温度进行多次循环，再将扩增DNA产物通过琼脂糖凝胶电泳染色法、Southern印迹法、酶谱分析法和序列分析法四种方法之一，检测出病原体的核酸。

2.探针杂交

将放射性核素或非放射性物质标记的已知序列核酸单链探针和固定在固相载体上的标本中病原体核酸退火形成双链杂交休。通过杂交标记物的检测，鉴定标本中的相应病原体基因。

3.生物芯片技术

通过缩微技术，根据分于间特异性地相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程，集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。生物芯片技术与传统的仪器检侧方法相比具有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等特点。按照生物芯片的制作技术，可以将生物芯片划分为微矩阵和原位合成芯片。

目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的微阵列，也被称为基因芯片或DNA芯片。按照载体上点的DNA种类的不同，基因芯片可分为寡核苷酸和cDNA两种芯片。按照基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等。

4.序列分析

指通过一定的方法确定DNA上核苷酸排列的顺序，包括序列比对，序列分析即在核酸序列中寻找基因，找出基因的位置和功能位点的位置，以及标记已知的序列模式等过程。随着全自动测序技术的快速发展，DNA测序结果通过生物信息学分析，获取需要的信息，应用越来越广泛。

5.其他体外扩增技术

分子生物学检验（分子诊断）技术发展迅猛，日新月异，如环介导等温扩增（LAMP）、依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）等技术，逐步在临床实验室得到应用。

血清学诊断是指用已知病原体抗原检测患者血清中相应抗体的方法以诊断感染性疾病。常用的方法有凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、间接免疫荧光检测等。血清学诊断试验的价值常用敏感性、特异性和预测值来评价。临床医生必须合理选择试验项目，达到确诊某一次病、排除某一疾病或监测疾病治疗的目的。